软骨肉瘤中CDK4及P16诊断标志物的应用

软骨肉瘤中CDK4及P16诊断标志物的应用

王克猛

王克猛

邢台医学高等专科学校第一附属医院054000

【摘要】目的：观察软骨肉瘤中CDK4及P16蛋白的表达情况，探讨其这两者在软骨肉瘤肿瘤细胞恶性增殖中的作用机制。方法：以SP法检测肿瘤组织中CDK4及P16蛋白表达的情况。结果：软骨肉瘤组织中CDK4呈高表达，阳性表达率随分化程度降低而逐渐增高。P16呈低表达，阳性表达率随分化程度降低而逐渐减少。结论:CDK4蛋白高表达及p16蛋白低表达在软骨肉瘤的发生发展中起协同作用，这两种异常相联合使肿瘤细胞获得更大的生长优势，从而在肿瘤的发生及发展起着重要的作用。

【关键词】软骨肉瘤；CDK4蛋白；P16蛋白

软骨肉瘤(CHS)是来源于软骨组织，其发病率约占原发性恶性骨肿瘤的20%，仅次于骨肉瘤之后，列第2位[1]。软骨肉瘤对放疗、化疗等辅助治疗手段不敏感，多以局部或广泛的手术切除为主要治疗手段，但切除后复发及转移的几率较高，预后往往很差。软骨肉瘤的分子靶向治疗具有特异性高、损伤小、毒副作用小的特点，已成为继手术、放疗和化疗之后的新的治疗手段，因此，寻找用于治疗软骨肉瘤的靶点具有十分重要的意义。

1材料与方法

1.1材料随机选取河北省第三医院病理科、邢台医专第一附属医院病理科2008年3月～2011年10月期间手术切除经病理明确诊断为软骨肉瘤的存档病例，复习原切片及免疫组织化学资料，筛选出普通型软骨肉瘤46例，患者年龄5-83岁，中位年龄43.7岁；男性25例，女性21例；其中组织学分级Ⅰ级16例、Ⅱ级20例、Ⅲ级10例；发生部位：股骨27例，髋骨（髂骨、耻骨、坐骨）11例，其他部位8例。所有患者均为散发病例，且为初次手术，术前均未经放射治疗或化疗。另外选取骨软骨瘤18例及正常软骨组织10例作为对照。

1.2方法所有标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规取材、脱水，石蜡包埋，4μm厚切片，连续切片，贴于涂有APES的载玻片，用SP法进行免疫组织化学法染色。鼠抗人CDK4单克隆抗体、鼠抗人P16单克隆抗体试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术公司，免疫组化染色按试剂盒操作说明进行，染色过程中设阳性和阴性对照，阳性对照用已知阳性切片，阴性对照采用PBS代替一抗。

1.3免疫组化染色结果判断标准CDK4蛋白阳性表达主要定位于细胞核内，为棕褐色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布。显微镜下盲法阅片，400×高倍镜下随机观察10个视野（向同一方向移动切片，不重复，不重叠）每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数。标本无阳性反应细胞或阳性反应细胞率小于10%为阴性；标本阳性细胞呈淡棕黄色或阳性反应细胞率介于10-50%为阳性（+）；标本阳性细胞呈深棕黄色，且阳性反应细胞率大于50%为强阳性（++）[2]。p16蛋白免疫组织化学染色阳性反应为棕黄色和(或)棕褐色颗粒，阳性表达定位于细胞核或(和)细胞浆上，400×高倍镜下随机观察10个视野（向同一方向移动切片，不重复，不重叠），每个视野计数100个肿瘤细胞中的阳性细胞数，观察阳性细胞与细胞总数的比例关系。无阳性细胞为阴性(-)；表达≤50%为阳性(+)；>51%为强阳性(++)[3]。

1.4统计学分析所有数据输入计算机，先用Excel进行数据整理，再用SPSS17.0统计软件包采用用χ2检验，检验标准为P<0.05有统计学意义。

2结果

2.1CDK4在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达情况

CDK4蛋白阳性表达主要定位于细胞核，表现为细胞核内有棕黄色颗粒。在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中CDK4阳性表达率分别为20%（2/10）、38.9%（7/18）、63%（29/46）。在骨软骨瘤及软骨肉瘤中的阳性表达率明显高于正常软骨组织（P<0.05），而软骨肉瘤中的阳性表达率明显高于骨软骨瘤（P<0.05）。CDK4蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同组织学分级中的软骨肉瘤中阳性表达率分别为31.3%（5/16）、75%（15/20）和90%（9/10），阳性表达率随分化程度降低而逐渐增高（P<0.05）。（表1、2）

2.2p16在正常软骨组织、骨软骨瘤及软骨肉瘤中的表达情况

p16蛋白阳性表达主要定位于细胞核或/和细胞浆上，表现为细胞核或/和细胞浆内有棕黄色颗粒出现。在10例正常软骨组织及18例骨软骨瘤中的p16蛋白均为阳性表达情，而在软骨肉瘤中的p16阳性表达率为39.1%（18/46）。在正常软骨组织、骨软骨瘤中P16蛋白的阳性表达率明显高于软骨肉瘤组织（P<0.05）。p16蛋白在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同组织学分级中的软骨肉瘤中的阳性表达率分别为62.5%（11/16）、30%（6/20）和20%（1/10），阳性表达率随分化程度的降低而降低（P<0.05）。（表3、4）

2.3CDK4及p16蛋白与软骨肉瘤主要临床病理资料间的关系

统计结果显示，CDK4及p16蛋白的表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及体积大小均无统计学意义（P＞0.05，表5）。

3讨论

P16基因定位于9p21，是一种抑癌基因，在正常细胞生长调控中起着至关重要的作用，与细胞分化及预后有关。其表达产物p16蛋白与CyclinD竞争性特异性结合细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4而抑制Rb磷酸化，从而抑制细胞周期从G1进入S期，对细胞增殖周期起负性调节作用。当P16基因出现异常改变、缺失或突变以及功能丧失时，它可抑制CyclinD-CDK4的活性，使细胞周期加速，DNA在还没修复前就迅速从G1期进入S、G2、M期，细胞过度增殖从而导致细胞失控性生长和肿瘤的形成。p16蛋白失活、CDK4过表达使细胞获得无限增殖能力，向恶变发展，这是它们参与肿瘤进展的一个机制。

本实验中，CDK4在软骨肉瘤中CDK4的阳性表达率明显高于骨软骨瘤（P<0.05），而且Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ不同组织学分级中的软骨肉瘤中阳性表达率随分化程度降低而逐渐增高，其阳性表达与组织学分级密切相关（P<0.05）。提示CDK4蛋白高表达及p16蛋白的缺失可能是软骨肉瘤发生、发展的重要因素，是肿瘤细胞增殖的重要机制，可作软骨肉瘤诊断的分子生物学标志之一，为制订正确合理的治疗方案提供依据，那么我们通过使用CDK4抑制剂或导入野生型p16基因，达到阻止癌细胞增殖的目的，从而为软骨肉瘤的分子靶向治疗提供依据。

附表

参考文献

[1]蒋智铭,张惠箴,郑莉.骨关节肿瘤和瘤样病变的病理诊断[M].第1版.上海:科技教育出版社,2008:51-68

[2]司晓辉,金岩,杨连君.细胞周期素依赖激酶4在颌骨软骨肉瘤的表达及意义[J].第四军医大学学报,2000;21(8):929-931

[3]郭成学p16蛋白与软骨肉瘤临床病理特征及预后关系[J].中原医刊.2006,9,33(18)84-85