TNFα、NF-κB和PPAR-γ在MODS大鼠外周血中的表达

TNFα、NF-κB和PPAR-γ在MODS大鼠外周血中的表达

乔万海1周婷2王立明1古长维1

乔万海1周婷2王立明1古长维1(1西安交通大学第二附属医院急诊科710004；2汉中职业技术学院附属医院723000)

【摘要】目的探讨TNFα、NF-κB和PPAR-γ等在MODS大鼠外周血中的相互关系。方法脂多糖（LPS）静脉注射法制造大鼠脓毒症模型，分别在第1天、5天、10天、12天用酶联免疫吸附剂测定法检测外周血中TNF-α的水平，外周血单个核细胞内转录因子PPARγ、NF-κBp65表达。结果TNFα和NF-κB在模型组大鼠外周血中，第1天表达逐渐增强，第5天起高水平表达一直持续至12天(P<0.01)。PPAR-γ在对照组和第1天模型组外周血中表达最强，第5天表达开始减弱。TNFα和NF-κB在外周血的表达呈明显正相关关系，与PPAR-γ则呈负相关关系(P<0.01)。结论TNFα和NF-κB与大鼠脓毒血症程度呈正相关，而PPAR-γ则相反。

【关键词】TNFαNF-κBPPAR-γMOD

【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）33-0117-03

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheTNFα,NF-κBandPPAR-γ,suchasMODSinratperipheralbloodofmutualrelations.Methodslipopolysaccharide(LPS)intravenousinjectionofratsepsismodelofmanufacturing,inthe1stday,5days,10days,12daysbyenzyme-linkedimmunosorbentassaydetectedinperipheralbloodlevelsofTNF-α,PeripheralbloodmononuclearcellswithtranscriptionfactorsPPARγ,NF-κBp65expression.TNFαandtheresultsofNF-κBintheratmodelofperipheralblood,the1stdayofexpressiongraduallyincreased,the5thdayofahighlevelofexpressionuntil12days(P<0.01).PPAR-γinthecontrolgroupand1daymodelgroupofperipheralbloodtoexpressthestrongest,the5thdayofexpressionbegantodecline.TNFαandNF-κBintheperipheralbloodshowedapositivecorrelationbetweenclear,andPPAR-γisanegativecorrelation(P<0.01).ConclusionTNFαandNF-κBandperipheralblooddiseasehaveagooddegreeofconsistencyintherelationship,PPAR-γonthecontrary.

【Keywords】TNFαNF-κBPPAR-γMODS

肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNFα)在大量促炎介质中，居于首要地位，是MODS时机体最先出现的、起关键作用的介质，并且TNF-α能刺激其他几种促炎性细胞因子如IL-1β、IL-6、IL-8等的产生，注入超大剂量的TNF-α可引起典型的SIRS，并进而导致MODS的发生[1]。核转录因子(nuclearfactorκappaB,NF-κB)是复杂炎性反应放大环路的重要转录因子，存在于所有细胞中，在免疫应答、应激反应、细胞凋亡及病毒复制的调节中起主导作用[2]。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorγ,PPAR-γ)是一个细胞增殖和免疫反应的调节剂，可调节炎症相关基因的表达，参与机体的炎症反应过程，且抗炎作用强大，抑制单核-巨噬细胞活化，减轻炎症细胞浸润和减少炎症因子释放等而发挥抗炎作用，从而对机体器官功能损害起保护作用[3]。国内在这方面的研究还很少。本实验拟对TNFα、NF-κB和PPAR-γ等在MODS大鼠肝组织中不同阶段的表达进行检测，研究它们之间的相互关系及其炎症坏死发生、发展过程中的作用，为临床治疗MODS提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验仪器与试剂

罗格列酮(葛兰素史克有限公司);脂多糖(E.ColiO55:B5,美国Sigma公司);二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司);NF-κBp65、PPARγ免疫组化试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。大鼠淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司);TNF-α酶联免疫试剂盒(ADL公司);

1.2造模

健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠90只，体重（250±30）g，随机分为二大组，每组45只：正常对照组、实验组。每大组又按测定指标的时间不同分为1天、5天、10天、12天处理组。正常对照组大鼠：股静脉注射10%二甲基亚砜（DMSO）1ml/kg，30min后股静脉注射生理盐水2ml/kg。实验组：股静脉注射10%DMSO1ml/kg，30min后股静脉注射LPS6mg/kg。造模成功后分别于1天、5天、10天、12天，在各实验组和对照组中随机取10只大鼠，硫喷妥钠30mg/kg体重腹腔注射麻醉，心包腔无菌穿刺采血处死，抽取3ml肝素抗凝血用于外周血单个核细胞的分离，收集3ml血液用于外周血中TNF-α的检测，所抽血样放入37℃水浴箱内静置1小时，1000转/分离心2分钟，将上层血清抽取后转入封存管中置入-20℃冰箱冷冻保存。

1.3外周血单个核细胞内PPARγ、NF-κBp65表达的检测

大鼠外周血单个核细胞的分离及细胞涂片的制备[4]

1）取肝素抗凝血3ml与Hank,s液1:1混匀后，小心加入6ml的大鼠淋巴细胞分离液之上，以2000r/min离心（直径15cm水平转子）15分钟，收集灰白色界面层的细胞即为单个核细胞，其中包括淋巴细胞、单核细胞和一些血小板。

2）在收集的细胞中加入Hank,s液5ml，充分混匀后，以2000r/min离心10分钟。

3）吸去上清液，沉淀用Hank,s液反复洗2次（2000r/min，10min）。

4）将沉淀涂在用多聚赖氨酸处理过的载玻片上，自然干燥，后放入纯丙酮内固定5分钟，蒸馏水冲洗一遍，晾干。

采用武汉博士德生物工程有限公司提供的试剂盒进行外周血单个核细胞内PPARγ、NF-κBp65表达的检测，具体方法按实际说明书进行。

将PPARγ、NF-κB的免疫细胞涂片经Q550CW图像信号采集与分析系统（西安交通大学医学院实验中心）进行图像分析，每张涂片随机选取5个不重叠的高倍镜视野，测定阳性细胞的平均灰度值，分析过程中所有切片的放大倍数、光源强度均相同。

1.4大鼠外周血中TNF-α的检测：

将待测血清置入4℃冰箱自然解冻后放入25℃水浴箱内，将本实验采用的ADL公司提供的酶联免疫试剂盒平衡至室温（20-25℃），进行大鼠外周血中TNF-α的检测，检测方法按实际说明书进行。

1.5统计学处理

数据的统计学分析采用SPSS13.0分析软件。各参数用均值±标准差（x-±S）表示。组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1TNFα在模型组大鼠外周血中的表达：TNF-α值从开始即明显升高，在第10天达到高峰。与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。见表一。

表一两组实验动物外周血中TNF-α值的水平（pg/ml）

组别1天5天10天12天

Control107.87±11.05130.98±15.05-115.67±13.75-104.65±12.05-

LPS335.89±21.20#519.03±39.84#543.39±24.39#510.12±13.07#

注：#P<0.01与同时相的Control组比较；*P<0.05与同时相的Control组比较；##P<0.05与同时相的LPS组比较.

2.2NF-κB在模型组大鼠外周血单核细胞中的表达：外周血中单个核细胞内NF-κB的表达从第1天起开始升高，在第5天达到最高值，与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。见表二。

表二两组实验动物外周血中单个核细胞内NF-κB的表达（灰度值）

组别1天5天10天12天

Control125.81±3.05127.31±2.57116.46±4.26121.54±3.50

LPS199.48±4.94#257.20±3.84#271.65±5.39#261.35±4.78#

注：#P>0.05与同时相的Control组比较；*P<0.05与同时相的Control组比较；##P<0.05与同时相的LPS组比较.

2.3PPAR-γ在模型组大鼠外周血单核细胞中的表达：PPAR-γ在对照组和第1天模型组大鼠外周血中表达最强，从第5天在模型组中的表达开始减弱，与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。见表三。

表三两组实验动物外周血中单个核细胞内PPARγ的表达（灰度值）

组别1天5天10天12天

Control110.54±5.05115.98±4.23106.35±4.56118.36±4.69

LPS161.01±4.94#131.20±3.84#124.65±5.39#120.35±4.78#

注：#P>0.05与同时相的Control组比较；*P<0.05与同时相的Control组比较；##P<0.05与同时相的LPS组比较.

TNFα和NF-κB在MODS模型组大鼠外周血中，从开始即明显升高，在5天达到高峰。与对照组相比已有显著性差异(P<0.05)。对照组则无明显变化（P<0.01)。PPAR-γ在对照组和第1天模型组大鼠外周血中表达最强，从第5天在模型组中的表达开始减弱。

2.4TNFα、NF-κB和PPAR-γ在大鼠外周血中表达的相互关系

从本实验可明显看出，TNFα和NF-κB呈明显正相关关系，相关系数r=0.98，P<0.01。TNFα和PPAR-γ在MODS大鼠肝细胞中的表达呈负相关关系，相关系数r=-0.74，P<0.05。在脓毒症形成之初,PPAR-γ呈高水平表达；而随着脓毒症的进展，TNFα、NF-κB表达增强，PPAR-γ的表达则逐渐减弱。

3讨论

炎症反应在SIRS和MODS发生发展中起重要作用。因此，通过阻断炎症的激活，在一个较高的水平上对产生炎性介质的总体环节进行控制，是防止MODS发生发展的新的治疗途径。

本实验观察到TNF-αNF-κB的水平从开始第1天起开始升高，在第5天达到最高值，随后逐渐下降，与对照组相比已有显著性差异。证明在脓毒症的发生发展中有TNF-α的大量失控性释放，而NF-κB是一种能与多种细胞基因的启动子和增强子中的κB序列位点发生特异结合的核转录因子，具有广泛的生物学活性。受感染、创伤、氧化应激、内毒素等多种刺激活化后，能启动和调控众多炎性介质的基因转录。通过激活细胞因子级联，生成促炎介质，抑制炎性细胞调亡。本实验发现PPAR-γ在对照组和第1天模型组大鼠外周血中表达最强，从第5天在模型组中的表达开始减弱，与对照组相比已有显著性差异，说明在脓毒症形成之初,PPAR-γ呈高水平表达；而随着脓毒症的进展，PPAR-γ的表达则逐渐减弱。

近年来，PPAR-γ的抗炎特性逐渐被人们认识并接受，不少学者把PPAR-γ配体作为治疗MODS的新靶点和新手段。由于PPAR-γ结构与功能的复杂性,现仍有很多未知领域有待进一步的研究和阐明。相信随着以上问题的解决,PPAR-γ配体将会成为MODS等临床危重症的防治提供一种新的手段。而MODS的发生机制是错综复杂的[5],其中炎症细胞的普遍激活和介质释放是基本机制,以TNF-α为主的细胞因子最终引发和导致了器官损害[6]。NF-κB是重要的转录因子,活化后发生核移位,与靶基因结合,广泛调控TNF-α等细胞因子[7]。是否能通过PPAR-γ激动剂来促使PPAR-γ的产生来抑制前炎症因子TNFα、NF-κB，从而对MODS大鼠器官起到保护作用值得进一步研究。

参考文献

[1]乔万海，屈莉，师猛，王立明.MODS大鼠外周血中PPARγ与TNF-α、IL-10动态变化的研究[J].第四军医大学学报，2009,40(4):21-22.

[2]鲁晓岚，罗金燕，胡长根，等.三种大鼠脂肪肝模型的比较[J].胃肠病学和肝病学杂志，2005,14(3):243-248.

[3]乔万海，裴红红，师猛.多器官功能障碍综合征患者外周血中过氧化物酶增殖激活受体-γ与血小板活化因子的相互关系研究[J]。中国急救医学杂志2004,3(Suppl1):S12.

[4]乔万海，王静，师猛.罗格列酮对脂多糖诱导的多器官功能障碍综合征大鼠保护作用的研究[J].中国急救医学杂志2007,40(4):65-66.

[5]乔万海，王静，屈莉，王立明。罗格列酮对MODS大鼠外周血单个核细胞内NF-κB表达的影响[J].医学研究杂志,2009,39(4):54-55.

[6]KotronenA,VehkavaaraS,Seppl-LindroosA,etal.Effectofliverfatoninsulinclearance[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2007,293(6):1709-1715.

[7]鲁晓岚，罗金燕，张双保，等.抗TNF抗体和谷胱甘肽对大鼠脂肪肝的防治作用研究[J].胃肠病学和肝病学杂志,2007,16(6):555-560.