湖南石菖蒲水提液部位HPLC特征指纹图谱研究

湖南石菖蒲水提液部位HPLC特征指纹图谱研究

赵曦1周晓东2

赵曦1周晓东2

（1吉林大学珠海学院519041;2珠海市食品药品监督管理局519000）

【摘要】目的建立湖南石菖蒲水提液部位HPLC分析色谱条件，建立水提液部位标准指纹图谱。方法色谱条件：WatersCosmosilC18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇：3%三乙胺（磷酸调PH到4.0）=56:44；检测波长：245nm；柱温：28℃；流速：1.0ml/min；进样量：15μl。结果标定共有指纹峰6个，峰型较好，峰面积稳定，相似度均在0.90以上,与其他成分分离较好。结论方法准确性可靠，重现性好，可用于石菖蒲药材水提液部位的指纹图谱研究。

【关键词】石菖蒲水提液指纹图谱HPLC

【中图分类号】R282.71【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）15-0023-03

石菖蒲来源于天南星科Araceae菖蒲属Acorus植物石菖蒲AcorustatarinowiiSchott的干燥根茎,根茎中主要含有挥发油，故多重视其挥发油成分的研究。但根据近年来有关石菖蒲水提液部位现代药理研究的报道，其开窍豁痰、醒神益智、化湿和胃的功效并不局限于挥发油部位。有研究表明石菖蒲水提液对抗抑郁[1]、抗癫痫[2]及小鼠吗啡依赖戒断[3]具有一定疗效。本文所用石菖蒲来源于湖南，采用水蒸气蒸馏法，去除挥发油得到水提液部位，二极管阵列对最佳检测波长进行筛选，确定相关色谱条件，建立湖南石菖蒲水提液部位特征指纹图谱，报道如下。

一材料

1，样品来源

样品收自湖南邵东县药农，产自附近丘陵，海拔约200米，分为个子货及饮片，带少量泥土，完整者根茎分叉，数量2～5个不等；表皮红棕色，粗糙，节1.5～3cm；断面微红色，内皮层环纹明显，可见维管束小点及棕色油点；气芳香，香气浓。经珠海市药监局主任药师、广州中医药大学客座教授周晓东鉴定为天南星科植物石菖蒲的干燥根茎。采收时间及规格见表1：

表110批湖南石菖蒲药材采收时间及规格

2，仪器与药品

美国Agilent1200series二极管阵列检测器；日本岛津LC-2010A高效液相相色谱仪；甲醇：色谱纯，购于天津四友生物医学技术有限公司；三乙胺：分析纯，购于广州化学试剂厂；磷酸：分析纯，购于广州化学试剂厂；正丁醇：分析纯，购于广州化学试剂厂；水：超纯水。

二方法

1，色谱条件

WatersCosmosilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇：3%三乙胺（磷酸调PH到4.0）=56:44；检测波长：245nm；柱温：28℃；流速：1.0ml/min；进样量：15μl；指纹图谱采集时间60min。

2，供试品溶液的制备,

取药材5g，粉碎成1～2cm的粗粒，加20倍量的水，水蒸气蒸馏法提取挥发油10小时，弃去挥发油，收集水提液部分，滤过，滤液减压浓缩至1.10～1.15(50℃)，用等量水饱和正丁醇提取4次，合并正丁醇液，减压回收正丁醇，残留物真空干燥（-6.86Kpa，70℃），用水溶解，定容到10ml量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤，进样15μl。

3，方法学考察

为了考察分析方法的可靠性，选取编号2、3、4的样品，分别对其仪器精密度、稳定性和实验方法重复性作了相应考察。

（1）精密度试验

取供试品溶液，连续进样6次，相似度值均为1.000，各共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积的相对标准偏差（RSD）小于3%，结果表明仪器精密度良好。

（2）稳定性试验

取供试品溶液，分别于配制后0h、12h、24h、48h进样，相似度值均在0.990～1.000之间，各共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积的相对标准偏差（RSD）小于3%，结果表明供试品溶液在室温下放置48h稳定。

（3）重现性试验

将同一药材样品按2.2项下依法制成5份进样，相似度值均为1.000，各共有峰的相对保留时间和相对保留峰面积的相对标准偏差（RSD）小于3%，结果表明重现性良好。

三HPLC指纹图谱的建立

1，参照物的选择

取批号为09032801的石菖蒲药材，按2.2项下配制供试品溶液，在上述色谱条件下，进样分析，得到HPLC指纹图谱，见图1。由图可见保留时间为20.2min的色谱峰，峰高最高，峰型较好，峰面积稳定，与其他成分分离较好，因此本研究选择该峰作为参照物（S）。

图1湖南石菖蒲水提液部位参照物图谱

2，对照谱图的生成及共有指纹峰的标定

取批号09032801～09032810的10批湖南石菖蒲药材，按2.2项下配制供试品溶液，按上述考察的色谱条件进行分析，得到HPLC指纹图谱，见图2。将图谱导出，用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》生成对照指纹谱图。生成方法：平均数法；时间窗宽度：0.10。结果见图3：

图210批湖南石菖蒲药材水提液部位指纹图谱

图310批湖南石菖蒲药材水提液部位对照谱图

3，指纹图谱技术参数

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004B版》对指纹图谱技术参数进行归纳计算，分别以S峰的保留时间及峰面积为1，计算各色谱峰的相对保留时间及相对峰面积；计算相似度；计算非共有峰面积及其占总峰的百分比。见表2～5：

表2共有峰相对保留时间

表3共有峰相对峰面积

表4非共有峰面积

表5共有峰相似度计算结果（n=10）

四讨论

1，色谱柱的选择

比较了以下三种色谱柱：ThermoBDSHypersilC18柱（4.6mm×250mm，5μm）；SHIMADZUC18柱(4.6mm×150mm，5μm)；WatersCosmosilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)。比较所得色谱图，从中选择了WatersCosmosilC18柱(4.6mm×250mm，5μm)，该色谱柱峰分离效果好，数量较多，峰型较佳，拖尾因子小。

2，检测波长的确定

本研究采用二极管阵列检测器对以下检测波长进行选择：205nm、213nm、214nm、215nm、218nm、220nm、225nm、228nm、230nm、235nm、240nm、245nm、250nm、255nm、260nm、265nm、270nm、275nm、285nm、290nm、295nm、300nm、305nm。结果表明，检测波长245nm处，所得各色谱峰具代表性，包含信息量较多，且各色谱峰分离度较好。

3，提取条件的选择

石菖蒲水蒸气蒸馏过程中，针对加水量、粉碎度、浸渍时间、提取时间四个方面因素，各拟定3水平，进行正交试验。结果表明石菖蒲切成1～2cm粗粒，加20倍水，加热蒸馏提取10小时，弃去尽可能多的挥发油；正丁醇部位的萃取减压回收，目的是为了除去蛋白质、氨基酸、色素等水溶性杂质，同时增大水提液部位主要成分的溶解度，减少对色谱柱的污染堵塞，优化被测成分的峰型。

4，湖南石菖蒲标准指纹图谱的建立

根据10批湖南石菖蒲药材水提液部位的测定结果，标定共有指纹峰6个。6个共有峰峰型较好，峰面积稳定，与其他成分分离较好，其他分离度较差的峰，如保留时间范围在4.5～5.5min、6.0～11.2min可作为石菖蒲药材水提液中间体的特征指纹区，作为比对参考。在所有共有峰中，单峰面积占总峰面积小于20%，大于10%的有1个，为1号峰，峰面积差值小于25%。其余各峰峰面积占总峰面积小于10%。2号峰、4号峰相对峰面积差值较大说明这两个成分在不同批次的药材中含量有较大的差异。10批样品中，相对保留时间的RSD均小于1%；非共有峰的峰面积占总峰面积的百分比小于10%。石菖蒲挥发油及水提液部位均有一定的药理作用，本研究为石菖蒲药材质量标准的完善和湖南产石菖蒲的种质鉴定提供了一定的依据。

参考文献

[1]李明亚,陈红梅.石菖蒲对行为绝望动物抑郁模型的抗抑郁作用[J].中药材,2001,24(1):40

[2]陈俐,廖卫平.石菖蒲水煎剂抗癫痫动物模型的药效学研究[J].广州医学院学报,2002,30(3):l3

[3]刘秀平,王亚龙,张宏馨,潘颖.石菖蒲水煎剂对吗啡依赖大鼠戒断症状的治疗作用[J].中国疼痛医学杂志,2007,(03):25