新型布尼亚病毒及其检测研究进展

新型布尼亚病毒及其检测研究进展

董雪1(通讯作者)王秋雨2李欣1刘娜1

董雪1(通讯作者)王秋雨2李欣1刘娜1

（1沈阳市疾病预防控制中心110031；2辽宁大学生命科学院110036）

【摘要】近年来在河南、山东等地出现的“蜱虫叮咬事件”是由蜱作为传播媒介，病原体为新型布尼亚病毒的传染疾病，该病严重者可致多脏器功能衰竭、弥漫性血管内凝血，病死率高达10%。布尼亚病毒是媒传疾病中重要的病毒类群之一，传播媒介囊括了医学节肢动物和啮齿动物，如蚊虫、白蛉、蠓、鼠等，宿主动物为哺乳动物。本文综述了新型布尼亚病毒病原学、所致疾病、感染和免疫应答以及检测的国内外研究进展，为该病毒感染的早期快速诊断、对症治疗和疾病预防等工作提供参考。

【关键词】布尼亚病毒病原学感染免疫应答检测

【中图分类号】R51【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）48-0023-03

AnoverviewofBunyaviridaeanddetection

DONGXue1WANGQiuyu2LIXin1LIUNa1

(1ShenyangCenterforDiseaseControlAndPrevention,Shenyang110031；2LiaoningUniversityAcademyofscience,Shenyang110031)

【Abstract】Itturnedoutthatthe“tickbiteevent”occurringinHenan,ShandongandotherplacesofChinainrecentyearwashumaninfectiousdiseasescausedbyanewBunyaviridaespreadbyitstickvector.Diseasescausedbythevirus,ifsevereenough,mayleadtomultipleorganfailure,disseminatedintravascularcoagulationandevendeathwithamortalityofabout10%.Bunyaviridaeisoneofthemostimportantvector-borneviruseswhicharespreadbymedicalarthropodsandrodentsincludingmosquitoes,sandflies,midges,ratsandothers,withmammalssuchasthehumanbeingasitshost.ThisreviewwasfocusedontheresearchprogressathomeandabroadonetiologyofNovelBuniavirus,caused-disease,infectionimmuneresponseanditsdetectiontoprovidereferenceforearlyandrapiddiagnosisofBuniavirusanditsprevention.

【Keywords】Buniavirusetiologyinjectionimmuneresponsedetection

布尼亚病毒（Buniavirus）是1943年在非洲乌干达西部布尼亚姆韦拉地区研究黄热病时发现的新病毒。之后的10年间，有更多的同类新病毒被发现，国际病毒分类委员会于1975年将这一类病毒统一归入同一病毒科，命名为布尼亚病毒科（Bunyaviridae）。媒传病毒主要隶属于布尼亚病毒科、黄病毒科（Flaviviridae）和披膜病毒科（Togaviridae）[1]。其中布尼亚病毒在世界上分布最为广泛，该科病毒已在任何有人居住的陆地上发现，可广泛感染节肢动物、植物和包括人类的哺乳动物，多数病毒可被节肢动物、啮齿动物媒介传播，并在自然界中以吸血节肢动物和易感脊椎动物为宿主进行循环[2]。

近年来，在我国中原地区的河南、山东、安徽、湖北、江苏和以及辽宁、浙江等12个省发生了近千例因被蜱叮咬而引发的媒介生物学传染病，数十人死亡。多数患者症状轻微，少数年纪大的，自身免疫功能低下的、贻误治疗的病人临床症状危重。重症患者的症状有高烧、头痛、幻觉、全身不适、恶心、呕吐、眼眶疼痛、腰痛、肌肉酸痛和精神萎靡等，并伴有白细泡、血小板进行性下降等症状[3]。蜱传疾病有明显季节性，4～9月为发病高峰。发病地区多位于浅山丘陵地带，草木茂盛，硬蜱活动活跃，人们经常遭受其袭击。人群对这类传染病普遍易感，发病多为农民，呈高度散发。使用强力霉素、四环素治疗有效[4]。

1布尼亚病毒的病原学研究

布尼亚病毒科(Bunyaviride)是一类有包膜的负链RNA病毒，该科病毒有５个属，30余个血清型，350余个种，其中4个为动物病毒属，1个为植物病毒属。4个动物病毒属为布尼亚病毒属（Bunyavirus）、汉坦病毒属（Hantavirus）、内罗病毒属（Nairovirus）和白蛉病毒属（Phlebovirus）。其中布尼亚病毒属最大，包括约160种病毒。

表1主要布尼亚病毒及其引起的人、畜疾病[5]

Table1RepresentativemembersoftheBunyaviridaeandthehumanandanimaldiseasesassociatedwiththem

布尼亚科病毒颗粒呈球形，具有囊膜，内有3个螺旋对称的核壳。病毒直径为80～120nm，表面具有长5～10nm的糖蛋白突起。这些突起包埋在厚度为5nm双层脂质膜内[6]。基因组含有大(L)、中(M)和小(S)3种负义或双义线形ssRNA片段。分子质量为6×106～7×106。病毒在感染细胞胞浆内复制，芽生于细胞高尔基区(Golgiapparatus)表面光滑的小泡，然后运送到细胞表面。基因组大基因片段长6875nt，含有单一读码框架，编码超大的依赖RNA病毒聚合酶，为病毒RNA复制和mRNA合成所必需。中基因片段长4458nt，含有单一读码框架，编码病毒糖蛋白(G1和G2或Gn和Gc)前体和非结构蛋白(NSm)。病毒糖蛋白从病毒表面伸出突起，使病毒吸附在宿主细胞受体上，并侵入宿主细胞[7]。小基因片段长961nt，编码核衣壳蛋白(N蛋白)和非结构蛋白(NSs)[8,9]。

2布尼亚病毒的感染与免疫应答

由于缺乏动物模型完全模仿人类疾病的发生过程，目前仅有少数布尼亚病毒科已经使用实验动物作为宿主进行感染与免疫应答研究[9]。

节肢动物传播布尼亚病毒科病毒的最好模型是建立鼠类LaCrosse病毒模型[10,11]。采用皮下接种的方法模仿节肢动物传播病毒途径，检测到病毒分布到横纹肌等组织中，并在这些组织中复制。复制导致病毒血症并可持续1周，在此期间，嗜血的媒介如蚊类可在吸血过程中被感染病毒并将病毒扩散到易感动物体内。在高水平的病毒血症模型动物中，可见病毒穿越血-脑屏障，侵袭中枢神经系统，但致病机制尚不清楚。在乳鼠体内，病毒在中枢神经系统内复制导致感染细胞凋亡，最终导致死亡性脑炎发生[11]。与节肢动物传播的病毒相反，汉坦病毒属在感染的啮齿动物中持续存在，主要分布于肺、唾液腺、肾，并可经排泄物的气溶胶循环传播[12]。实验研究表明，感染汉坦病毒属病毒后，主要特征是出现短、急的伴病毒血症的早期急性阶段，随后是长期阶段，以病毒脱落于啮齿动物的尿液中并随尿排出体外[13]。新生动物因体内带有来自母体的抗体而不受病毒感染，而裸鼠因缺少T细胞很快被Seoul型汉坦病毒感染[14]。人类感染病毒后，可产生急性反应引发致命的HFRS和肺出血热，疾病的发病机制尚不清楚[15]。

上述研究结果显示，布尼亚病毒的感染可分为急性感染（短暂的高水平的病毒血症，宿主或者是清除病原体到体外并幸免，或者被感染）和慢性感染（如啮齿动物携带汉坦病毒）。单一的感染引起宿主产生较高浓度的中和抗体用来保护机体免受同一株病毒的攻击[15]，CD4＋T细胞可以保护机体抗衡LaCrosse病毒[16]。因此，疫苗或对布尼亚病毒科病毒预防作用。

3新型布尼亚病毒检测

3.1病毒培养

采集急性期患者血液标本或尸检标本，接种乳小鼠和小鼠脑内是分离布尼亚病毒最敏感的方法。传代非洲绿猴肾细胞(Vero)、VeroE6细胞、人肺癌细胞(A549)和蚊细胞对布尼亚病毒也很敏感[17]。感染的细胞电镜下可观察到椭圆形或球形病毒颗粒。

3.2布尼亚病毒核衣壳蛋白(NP)Westernblot检测

从培养物上清液中布尼亚病毒RNA，RT－PCR扩增NP编码基因，产物回收、测序无误后用SfiⅠ酶切，连接至pComb3XSS载体，转化至大肠杆菌E．coliTop10F'感受态细胞，诱导表达。以纯化后的NP为抗原免疫Balb/c雌性小鼠，制备杂交瘤，得到NP单克隆抗体，纯化后标记辣根过氧化物酶(HRP)，用Westernblot法对急性期病人血清中布尼亚病毒NP进行检测。徐言等利用上述实验策略检测15例发热伴血小板减少综合症布尼亚病毒（SFTSV），在急性期病人血清全部成功检测到SFTSVNP，且与汉坦病毒、登革病毒感染者急性期血清及正常人血清不发生交叉反应[18]。

3.3双抗原夹心ELISA法检测SFTSV特异性总抗体

JiaoYJ等[19]将SFTSVNP编码基因用RT－PCR扩增，扩增后的NP基因克隆到PET－28(a)上，构建PET－28(a)－NP表达质粒，用大肠埃希菌BL21表达并纯化NP，用于包被和标记HRP，以此作双抗原，建立双抗原夹心ELISA法，检测SFTSV特异性总抗体。35例恢复期确诊病例血清全部阳性，65例汉坦病毒和登革病毒感染者全部阴性;与中和试验比较，187例中和试验阳性者该法全部阳性，灵敏度100%;467例中和试验阴性者该法465例阴性，特异性99.57%。

3.4新型布尼亚病毒的核酸检测

宋玉亮等以SFTSV基因组M节段的保守区为靶区域，设计特异性引物和Taqman探针，建立荧光定量RT－PCR检测方法，灵敏度在2×102拷贝/ml～2×103拷贝/ml之间，他们收集自疫区的40例临床诊断SFTS患者血液标本检测结果34例阳性，该方法与HBV、HCV、HCMV、EBV没有交叉反应[20]。吕燕宁等根据SFTSVS片段保守区域，选取1016bp～1086bp间的序列作为靶序列，设计一条序列中间位置1038－1060bp区间片段与负链互补的荧光标记探针，5'端以FAM标记，3'端连接淬灭分子TAMRA，建立MaqMan探针实时荧光RT－PCR[21]，检测结果灵敏度为4×102拷贝/ml。

ZhangYZ等根据L、M、S保守区分别设计引物和探针，3种引物和探针可以对L、M、S基因同时进行多重检测，也可分别单一检测[22]。该方法灵敏度10拷贝/μl。临床样品检测显示，54例发病2d～10d的SFTS确诊病例全部阳性，16例发病11d～20d的SFTS确诊病例15例阳性，临床样品灵敏度98.6%，114例肾综合征出血热、登革热、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎血清，仅1例肾综合征出血热出现假阳性，临床样品特异性99.1%，200例流行区和200例非流行区健康人血清均阴性，3种引物和探针的检出限和再现性一致。咽拭子标本、尿液标本、粪便标本也可用RT－PCR检出SFTSVRNA，阳性率分别为61%(28/46)、51%(20/39)和57%(13/23)。

4总结与展望

新型布尼亚病毒感染发病急、病情重、病死率高，同时可以通过接触病人血液等传播，早期快速实验室确诊对于早期诊断、早期隔离、早期治疗、早期防控具有重要意义。研究建立新型布尼亚病毒感染的实验动物模型，进一步深入研究其感染和发病机制、以及流行病学特点，是研究者面临的新任务，也是对症治疗的关键。

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基金项目：沈阳市科技局资金项目（F11-262-9-36）