关于抗绿脓杆菌活性物质的筛选与相关成分研究

关于抗绿脓杆菌活性物质的筛选与相关成分研究

刘爽

天津未名生物医药有限公司刘爽

关键词：抗绿脓杆菌；活性物质；筛选；成分

[中图分类号]R96[文献标识码]A[文章编号]1439-3768-（2019）-01-YS

0引言

绿脓杆菌与人类健康绿脓杆菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）是一种革兰氏阴性、无芽孢杆菌，广泛存在于自然界，也分布于皮肤、呼吸道和正常人的肠道当中，它们与外界沟通，尤其是在呼吸道感染的流行病中最常见的，当人体的免疫功能下降，容易发生呼吸道感染，绿脓杆菌有时候就会出现。目前，有研究指出，绿脓杆菌感染主要发生在重症监护病房，呼吸科、肿瘤科和老年医学部等场所。大部分的易感人群是中年和老年患者，或有严重的疾病，免疫力低下或长期的气管切开术施行过的患者当中，他们开放性的通气情况下，广泛使用的广谱抗生素会引起菌群失调。临床上以肺炎、败血症、腹腔炎症、烧伤、脓毒症、尿路感染最为常见，其中绿脓杆菌肺炎病死率高达30％以上，绿脓杆菌败血症的病死率达80％-90％。

1抗绿脓杆菌治疗的主要药物及其存在的问题

目前用于绿脓杆菌感染的治疗药物主要是抗生素。近年来，随着患者接受抗生素以及免疫抑制剂等，有些患者通过化疗以及各种侵入性诊断和治疗措施，绿脓杆菌对多种抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素的耐药性呈现出逐年上升的趋势。绿脓杆菌对亚胺培南的耐药率最低，亚胺培南可与多种青霉素结合蛋白结合（PBPs），抑制细菌细胞壁的合成，导致细胞溶解和死亡，且其对β-内酰胺酶稳定，是治疗绿脓杆菌重症感染的首选药物之一，但由于该类药在临床的大量使用，其耐药率也在逐年上升；阿米卡星对绿脓杆菌产生的钝化酶较为稳定，其耐药率不到20％，所以对绿脓杆菌重症感染患者的治疗应考虑β-内酰胺类抗假单胞菌药与氨基糖苷类的联合应用。

本次研究基于这一背景，采用实验检验方式，从最初的试剂、设备准备开始，针对抗绿脓杆菌活性物质展开筛选并研究其成分，报道如下。

2材料与方法

2.1材料与试剂

在这项研究中，由于研究主要集中在绿脓杆菌这一方面，既要注重实验的准备，又要关注相关药物的设置。具体而言，可分为培养基的准备、实验菌种的培养、土壤样品的选取、主要实验试剂的准备以及实验需要仪器的安排等，具体如下：

一是培养基的准备：培养基主要有发酵培养基与ＬＢ培养基两种。发酵培养基的制备包含1000ml蒸馏水、5ｇ氯化钠、3ｇ葡萄糖、5ｇ胰蛋白胨以及3ｇ酵母膏，将发酵培养基的酸碱值控制在7．2～7．4，制备完成后将培养基放在121℃的高温环境中半小时来高压、高温灭菌。LB培养基的制备包含1000ml蒸馏水、10ｇ氯化钠、5ｇ酵母膏以及10ｇ胰蛋白胨，同样将制备好的培养基酸碱值调节到7．2～7．4，放在121℃的高压、高温环境中灭菌0．5ｈ。除上述两种培养基外，还应制备复筛培养基以及固体培养基。复筛培养基的制备主要是在蒸馏水中加入浓度为5％的氯化钠溶液、2．5％的酵母膏以及5％的胰蛋白胨。固体培养基的制备方面，主要为抑菌作用并让其处于相对黏稠状态，因此在制备上需加入一定量的琼脂，具体而言，需在蒸馏水中加入浓度为2．5％的氯化钠溶液，

二是实验菌种的培养。本次研究中实验菌种主要有两种，即指示菌以及供试菌。指示菌为ＰＡ01，由医院本身研究提供。供试菌为Ｂ2002、Ｂ2001、Ｂ1506、Ｂ1505、Ｂ1503。

2.2拮抗绿脓杆菌的筛选与培养

正如前面提到的，土壤的选取是在我院的一处花园处。土壤被收集后，它需要被存储在4℃的环境中以避免影响培养的效果。在拮抗绿脓杆菌的筛选，该研究中使用的“双层板的方法”。首先制作下层部分，将出筛培养基与指示菌（研究中的指示菌为绿脓杆菌）混合均匀，使之成为下层培养基。上层部分的制作方面，首先应将已经妥善保存的土壤研磨充分，之后实施梯度稀释，取土壤悬液1ml倒入之前已经做好的下层培养基上。制作完成后，需将营养琼脂培养基倒入（需注意此培养基倒入时的温度需保持在50℃），在充分混合后上层培养基制作完成。整体的培养基需要放置在保持37℃的环境中，同时做好日观察记录。

2.3菌株的重复筛选

首先应将适合的菌株实施发酵，选取通过分离找出的带有拮抗绿脓杆菌能力的菌株，将其采用摇瓶方式发酵。使用之前制备好的复筛培养基，将其接种于锥形瓶中（锥形瓶中装液量控制在100ml/250ml），接种量在0．01，将其放在37℃环境中，使用250r/min摇振培养。在培养24ｈ之后，测定发酵液的酸碱值，并对比实验研究前发酵液的酸碱值。实验前酸碱值已经在培养基制备时保持在了7．2～7．4，因此若产生变化便可得出在发酵过程中菌株是否会产生有机酸或是有机减。最后实施蛋白酶的处理。将蛋白酶Ｋ配置成为溶液状态，比例为每毫升含5ｍｇ。在ep管中放入0．1ml蛋白酶Ｋ溶液，同时将0．4ml发酵液放入其中，让其最终浓度保持在1ｍｇ/ml。将溶液酸碱值调节到7．0左右。与此同时，需要在0．4ml发酵液中加入0．1ml的双蒸水，以此作为对照研究。将2组处理放在37℃环境中0．5ｈ，观察发酵上清液在抑菌活性上的变化，并将抑菌圈出现缩小趋势的菌株筛选出来备用。

3结果

3.1RDP研究

本次研究测定了5种菌株的同源性、相似度最高菌株以及ＲＤＢ分析，结果显示，Ｂ1506菌株同源性达到了100％，其余4种同源性为99％。且Ｂ1506与Ｂ1505为不动杆菌属，其余3项为假单胞菌属。

3.2拮抗绿脓杆菌分离菌形态研究

根据本次研究结果不难发现，不同菌株在特征上不尽相同，本次研究共研究了5种菌株，大部分为短杆菌，只有编号为Ｂ1506的菌株为杆菌。菌体直径方面，Ｂ1506的菌株直径最小，Ｂ2002菌体直径最大。

4讨论

对绿脓杆菌，土壤圈微生物的筛选是生态系统的一个组成部分，对微生物的生长和发展的必要环境。因此，其中的微生物主要集中的地方，品种多，而且数量极其大。一克肥沃土壤中通常含有几亿到几十亿个微生物，是一个十分丰富的菌种资源库，对于可以筛选出可以拮抗绿脓杆菌的微生物的可能性非常大。本实验通过多点采集的方法采集各类土壤样品，作为筛选抑菌活性物质产生菌的来源。经过优化的方法在筛选过程中起到了重要的作用，操作简单，结果灵敏准确，最终筛选出五株具有拮抗绿脓杆菌作用的菌株，分别编号为B2001、B2002、B1503、B1505、B1506。其中，B1505在筛选过程中表现最好，将其作为实验重点。本实验所采用的琼脂扩散法，是一种最广泛的筛选方法，操作简单实用。

参考文献：

[1]宫殿博,王小周,杨亮等.黄连水煎液与环丙沙星体外抗绿脓杆菌协同作用的实验研究[J].中外健康文摘,2013,(6):149-149,150.

[2]赵莉莉.以SecA动力泵为靶点的新型抗绿脓杆菌药物筛选模型的建立和应用[D].北京协和医学院,2008.

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