自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡探究

自身免疫调节因子促进THP-1细胞的自噬性凋亡探究

蒋红1，2杨明辉1，2，3张梦云2赵明才1，2，

川北医学院附属医院：1.风湿免疫研究所，2.医学研究中心，3.检验科；四川南充637000

摘要：目的：探讨分析自身免疫调节因子对于THP-1细胞发生自噬性凋亡产生的影响以及相关价值。方法：采用流式细胞仪、PI染色法以及AnnexinⅤ-FITC染色法对细胞凋亡率进行检测。结果：经过染色处理以后，其流式细胞仪检测结果表明，空载体转染细胞与阴性对照组的细胞凋亡率分别是（5.02±0.42）%与（3.86±0.46）%；质粒转染的细胞凋亡率是（10.01±0.69）%，同空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异具备统计学意义（P＜0.05）。而空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异不具备统计学意义（P＞0.05）。结论：自身免疫调节因子可以通过上调THP-1细胞的自噬而使其更迅速的凋亡。

关键词：自身免疫调节因子；THP-1细胞；自噬性；细胞凋亡

[Abstract]Objective：Toinvestigateandanalyzeeffectsofautoimmuneregulators

onautophagicapoptosisofTHP-1cellsandthevaluerelatingtoit.Methods：thecellapoptosisratewasdetectedbyflowcytometry，PIstainingandAnnexinstainingof-FITCv.Results：afterstaining，theflowcytometrytestshowedthattheapoptosisratesofemptyvectortransfectedcellsandnegativecontrolgrouparerespectively（5.02+0.42）%and（3.86+0.46）%；theapoptosisrateofplasmidtransfectedcellsis（10.01+0.69）%，thedifferenceisstatisticallysignificantcomparedwiththenegativecontrolgroupandemptyvectortransfectedgroup，（P<0.05）.Thereisnostatisticalsignificancebetweentheemptyvectortransfectedgroupandthenegativecontrolgroup（P>0.05）.Conclusion：autoimmuneregulatorscanupregulateautophagyofTHP-1cells，andthereforemaketheapoptosisofTHP-1cellsprogressmorerapidly.

[keyword]autoimmuneregulator；THP-1cells；autophagy；apoptosis

自身免疫调节因子（autoimmuneregulator，AIRE）作为转录调节因子，若基因突变则可以引发自身免疫性疾病，例如外胚层发育不良综合征与自身免疫性多腺体念珠菌病等[1]。因为自身免疫调节因子能够对外周组织抗原对于胸腔的异位表达进行调节，并对胸腺细胞的相关阴性选择进行调节[2]。所以，很多研究都把重点放在了自身免疫调节因子对于中枢免疫耐受的相关诱导的研究中[3]。相关研究显示，自身免疫调节因子作为前凋亡因子，其对于构建胸腺内自我耐受以及胸腺髓质上皮细胞的成长的微环境具备着至关重要的意义[4]。本研究中主要探讨分析了自身免疫调节因子对于THP-1细胞发生自噬性凋亡产生的影响以及相关价值，现总结如下：

1.资料与方法

1.1一般资料

本研究中主要涉及的研究材料主要有：含人全长的自身免疫调节因子的真核表达载体质粒pEGFP-AIRE；空表达载体pEGFP-C3购自BD公司；蛋白定量试剂盒和化学发光检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；兔抗人多克隆抗体以及蛋白提取试剂和羊抗兔均购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白酶抑制混合剂购自上海杰美基因医药科技有限公司；转染试剂以及低血清培养液购自HyClone公司。主要仪器设备：超净工作台[HFSafe1200，CO.，Ltd.（Hongkong）]、CO2培养箱（HealForceHF90）低温离心机（UNIVERSAC16R，USA）、倒置显微镜（OLYMPUSIX71）、流式细胞仪（FACScalibur，BD）等。

1.3方法

把已经转染的THP-1细胞经2000rpm的速率离心5分钟，采用PBS对细胞进行洗涤两次以后，将细胞密度调整为1×105/mL，并对细胞沉淀进行收集。根据细胞凋亡检测试剂盒上面的说明，将500μL结合缓冲液加入到沉淀内对细胞进行重悬处理。再依次将5μL碘化丙啶与5μLAnnexinⅤ加入到细胞悬液中，确保其均匀混合；在室温避光下反应15分钟。等到反应结束以后，采用上流式细胞仪对细胞凋亡情况进行检测。选择没有进行转染的细胞当作阴性对照。

1.4统计学方法

本研究采用统计学SPSS17.0对实施处理与统计，采取卡方对计数资料进行检验，采用t对计量资料进行检验，若P＜0.05则代表差异具有统计学意义。

2.结果

经过染色处理以后，对过表达自身免疫调节因子对于THP-1细胞自噬凋亡产生的影响进行分析研究，其中流式细胞仪检测结果表明，空载体转染细胞与阴性对照组的细胞凋亡率分别是（5.02±0.42）%与（3.86±0.46）%；质粒转染的细胞凋亡率是（10.01±0.69）%，同空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异具备统计学意义（P＜0.05）。而空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异不具备统计学意义（P＞0.05）。

3.讨论

在临床中，单核细胞是一种树突状细胞与巨噬细胞的前体来源细胞，其对于免疫调节与天然免疫具备着至关重要的意义[5]。单核细胞作为抗原提呈细胞与职业吞噬细胞，其适时适量的凋亡对于炎症反应的控制等具备着非常积极的效应，能够防止发生持续性的炎症反应，避免发生自身免疫性疾病[6]。因为自身免疫调节因子能够对外周组织抗原对于胸腔的异位表达进行调节，并对胸腺细胞的相关阴性选择进行调节[7]。其中，源自于自身免疫性疾病的自身免疫调节因子对于中枢免疫耐受的角色已经逐步的得到论证，但是自身免疫调节因子对于外周免疫耐受具备的作用还不是很明确，而利用调节单核细胞的自噬凋亡防止发生自身免疫性疾病也是一项非常关键的作用[8]。相关研究显示，自身免疫调节因子作为前凋亡因子，其对于构建胸腺内自我耐受以及胸腺髓质上皮细胞的成长的微环境具备着至关重要的意义。

本组研究结果显示：经过染色处理以后，其流式细胞仪检测结果表明，空载体转染细胞与阴性对照组的细胞凋亡率分别是（5.02±0.42）%与（3.86±0.46）%；质粒转染的细胞凋亡率是（10.01±0.69）%，同空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异具备统计学意义（P＜0.05）。而空载体转染在组与阴性对照组进行对比，差异不具备统计学意义（P＞0.05）。由此可知，自身免疫调节因子可以通过上调THP-1细胞的自噬而使其更迅速的凋亡。

结论：

综上所述，本研究中利用在THP-1细胞中过表达自身免疫调节因子证实了自身免疫调节因子可以通过上调THP-1细胞的自噬而使其更迅速的凋亡，由此进一步的对自身免疫调节因子对于外周免疫系统的作用进行了探讨，并为自身免疫性疾病提供了更多实验基础，但是如何介导细胞凋亡与调节细胞自噬凋亡还需要进一步研究分析。

参考文献：

[1]李子健，张幼怡，HaianFu.新信号复合物14-3-3/HIP-55介导细胞生存信号通路[A].中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C].2010，12（12）：59-61.

[2]李向利，丰平，刘树红，文朝阳，钱英，王学江.槲芪散及其君药槲寄生对肝癌前病变线粒体和相关凋亡蛋白酶表达的影响[A].中华中医药学会全国第十四次肝胆病学术会议论文汇编[C].2010，15（05）：113-115.

[3]MacedoC，EvangelistaAF，MagalhesDA，etal?Evidenceforanetworktranscriptionalcontrolofpromiscuousgeneex-pressioninmedullarythymicepithelialcells[J]?MolImmu-nol，2009，46（16）：3240-3244.

[4]张晓玲，郭连英，施广霞.蛋白酶体抑制剂对ASPP家族表达的影响[A].中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议论文汇编[C].2010，21（05）：35-37.

[5]ColomeN，ColladoJ，Bech-SerraJJ，etal?Increasedapoptosisafterautoimmuneregulatorexpressioninepithelialcellsrevealedbyacombinedquantitativeproteomicsapproach[J].JProteomeRes，2010，9（5）：2600-2609.

[6]宋志光，孙超，战卓，李杨，金英花.利用小分子探针研究CyclinA-Cdk2在细胞凋亡中的信号转导机制[A].中国化学会第27届学术年会第03分会场摘要集[C].2010，12（02）：26-28.

[7]荣晓凤，李荣亨，王维.气虚血瘀证大鼠血管平滑肌细胞bcl-2及bax相关凋亡因子的表达[J].中国老年学杂志，2010，22（11）：79-81.

[8]朱梅.17β雌二醇对氧化应激诱导的H9C2细胞凋亡的影响及其调控机制的研究[D].中国人民解放军军医进修学院，2009，25（04）：62-65.