结核分枝杆菌Rv0350基因克隆、表达及纯化

结核分枝杆菌Rv0350基因克隆、表达及纯化

文强1，2唐明美1何月娟1唐正洪1陈玲1

（1贵州省遵义医学院附属医院呼吸二科；贵州遵义563000

2山东省临沂市人民医院东医疗区；山东临沂276000）

摘要：目的：通过分子生物学技术对结核分枝杆菌Rv0350基因克隆、表达与纯化。方法：以结核分枝杆菌标准菌株H37Rv为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增，克隆Rv0350基因，与质粒pET-28a连接构建重组质粒，转入大肠杆菌BL21(DE3)，经异丙基半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过镍亲和层析获得纯化的重组蛋白。结果：对扩增后的基因进行电泳试验，证实成功重组目的基因，对重组纯化后的蛋白进行考马斯亮染、Weston-blot验证已成功重组Rv0350。结论：通过分子生物学技术可成功获得大量结核分枝杆菌Rv0350抗原，为后续功能与机理研究奠定基础。

关键词：结核分枝杆菌，Rv0350，克隆,表达,纯化

2015年结核病死亡人数首次超过艾滋病死亡数，结核病已成为全球疾病十大死因之一[1]。中国是全球30个结核病高负担国家之一[1]，2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查显示，全国肺结核病发病有下降趋势，但整体疫情不容乐观[2]。结核病积极有效的诊治仍是我国结核疫情防控的重点工作。

临床以痰涂片、培养为诊断结核病的依据，但痰涂片检查敏感性差；结核分枝杆菌培养周期长等缺点，对于肺外结核病、儿童结核病难以获取理想标本进行检测，临床急需开发早期诊断结核病的检查方法。被结核分枝杆菌感染后，人体的免疫反应比出现细菌学和病理学改变早，是否可通过血清学方法早期诊断结核病已成为结核病研究的热点。

本课题组前期通过双向凝胶电泳、质谱分析技术和蛋白芯片杂交技术检出多个结核病血清标志物，其中发现RV0350在活动及耐药结核病患者血清中呈现高表达特性。Rv0350基因表达热休克蛋白70（Hsp70），在应激状态下大量合成，又称为应激蛋白。为进一步验证Rv0350抗原诊断价值，本实验室通过分子生物学技术大量克隆、表达及纯化Rv0350，为进一步研究Rv0350抗原在活动及其耐药结核病中的作用及其机理，本研究拟通过分子生物学技术对结核分枝杆菌Rv0350基因克隆、表达与纯化，为后续研究奠定基础。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与载体人型结核分枝杆菌标准菌株H37Rv由贵州省疾病预防控制中心馈赠，原核表达载体pET-28a购于Novagen公司，感受态细胞DH5a和BL21购于天根生化科技有限公司。

1.1.2仪器与试剂仪器与试剂Pfu高保真PCR反应试剂盒购自于Trans公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、500bpDNAmarker、1KbpDNAmarker和卡那霉素均购自于天根公司，BamHI限制性内切酶、HindIII限制性内切酶及T4连接酶均购自于TaKaRa公司；蛋白预染marker购自于Thermo公司；组氨酸（6x-His）抗体购自美国Sigma公司；兔抗鼠抗体购自于美国Abcm公司；镍树脂购自于美国Invetrogen公司。

1.2方法

1.2.1引物设计及目的基因扩增Rv0350基因序列全长为1878bp，引物设计时，在上游引入BamHI（划线处）酶切位点，下游去掉终止子并引入HindIII（划线处）酶切位点，引物序列为：Rv0350上游引物P1:5’CGCGGATCCGCTCGTGCGGTCGGGATCG3’Rv0350下游引物P2:5‘CCCAAGCTTTCACTTGGCCTCCCGGCC3’。以结核分枝杆菌H37Rv为模板，P1、P2为引物在DNA扩增仪上进行目的基因扩增，反应条件：预变性94℃，4min；变形94℃，30s；退火55℃30s；延伸72℃，4min是，共34个循环，末次循环后补延72℃，10min，终止反应，回收PCR产物试剂盒。

1.2.2Rv0350基因克隆和诱导表达将目的基因和pET-28a分别进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切，产物回收加入T4连接酶16℃，连接过夜。取10μl链接产物转入感受态DH5α后均匀涂于含有50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基的培养皿，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB培养液，37℃摇菌过夜，提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳跑胶验证。验证成功后，将重组质粒再转入感受态BL21（DE3）进行培养，进行诱导表达，采用不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）,诱导过夜，聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）验证。

1.2.3Rv0350的纯化按照最佳诱导浓度对HSP70大量诱导，诱导蛋白均表达于上清，镍柱亲和层析法对目的抗原进行纯化，SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色初步验证。并进行WesternBlot进一步验证。

2.结果

2.1Rv0350基因扩增与质粒构建为扩增Rv0350基因，以P1、P2为引物，人型结核分枝杆菌标准菌株H37RvDNA为模版，经PCR仪扩增，将目的产物在1%琼脂糖凝胶电泳后，在2000bp附近可见有扩增产物条带，与目的基因大小相符（图1A）。切胶回收目的基因并和质粒pET-28a分别用行BamHⅠ和HindⅢ双酶切后连接，构建重组质粒pET28a-Rv0350。重组质粒转入DH5a细胞培养、孵育后提取质粒，再做双酶切，琼脂糖凝胶电泳验证，可见到目的基因（1878bp）和载体（5369bp），均可见相应条带（图1B），重组质粒构建成功。

2.2Rv0350的诱导表达和纯化重组质粒再转入BL21(DE3)细胞，培养、孵育后，用不同浓度IPTG少量诱导表达，行SDS-PAGE验证，显示1:20000IPTG诱导表达效果最佳，并且该蛋白溶于上清液中。用最佳IPTG诱导浓度对细胞进行大量诱导表达，细胞破壁、裂解后用亲和层析法纯化用不同浓度咪唑洗脱，洗脱液SDS-PAGE，考马斯亮染后在70kda附近可见蛋白条带（图1C），最后行WesternBlot验证（图1D）。

3.讨论

研究发现Hsp70能发挥多种作用，如辅助肽链折叠，蛋白质运输，防止过度聚集，调节酶活性[3-4],还能与非折叠链及近天然、错误折叠、过度聚集的蛋白质相互作用[5-6]。蛋白质折叠过程精细复杂，容易受生长发育期或外界环境的影响，导致蛋白不能折叠或者错误折叠［7］。当结核分枝杆菌被宿主吸入下呼吸道后，机体的肺泡巨噬细胞和粒细胞参与天然免疫反应，有少部分患者能清除体内病原体，但大部分患者则发生了结核分枝杆菌感染[8]。为抑制结核分枝杆菌生长，被感染的巨噬细胞趋化多种细胞集中到感染部位。抗原特异性T细胞围绕感染的巨噬细胞并诱导肉芽肿形成，抑制结核分枝杆菌生长[9]。肉芽肿的形成减少了结核分枝杆菌生长需要的营养成份，导致结核分枝杆菌通过休眠状态生存[10],宿主处于结核分枝杆菌潜伏感染状态。当宿主免疫水平下降，结核分枝杆菌大量繁殖，机体结核潜伏感染状态变为活动性结核，在此过程中，宿主细胞免疫[11]产生的免疫调节因子以及体液免疫[12]调节各种细胞内抗原包括结核分枝杆菌的免疫反应，大量细胞因子趋化、募集、激活巨噬细胞或NK细胞，杀伤繁殖的结核分枝杆菌。SeemaD.Shekhawat等研究发现宿主和结核分枝杆菌的Hsp在结核分枝杆菌潜伏感染组与结核分枝杆菌活动组中表达有差异[13]，提示在Rv0350基因在活动结核病中有重要作用。AmitSingh等从一例初始治疗的肺结核患者痰标本中分离出全敏感结核分枝杆菌，在治疗过程中该结核分枝杆菌发展成为耐多药菌，经双向凝胶电泳检测发现Rv0350等5个基因随耐药程度增加表达逐渐增高,基因分型技术排除了重复感染可能性[14]，提示Rv0350基因与结核分枝杆菌耐药相关。

本研究以pET28a为载体，成功克隆、表达、纯化了结核分技杆菌Rv0350抗原，为进一步验证Rv0350在活动结核病中的作用及机理奠定了基础。

参考文献：

[1]WorldHealthOrganization.globaltuberculosisreport2016[R]WHOReport2016

[2]全国第五次结核病流行病学抽样调查技术指导组.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志,2012,34(8):485-508.

[3]KirschkeE,GoswamiD,SouthworthD,etal.GlucocorticoidReceptorFunctionRegulatedbyCoordinatedActionoftheHsp90andHsp70ChaperoneCycles[J].Cell,2014,157(7):1685-97.

[4]SharmaSK,DelRP,ChristenP,etal.ThekineticparametersandenergycostoftheHsp70chaperoneasapolypeptideunfoldase.[J].NatureChemicalBiology,2010,6(12):914-920.

[5]MayerMP,BukauB.Hsp70chaperones:Cellularfunctionsandmolecularmechanism[J].Cellular&MolecularLifeSciencesCmls,2005,62(6):670-84.

基金来源：国家自然科学基金（81360002）