三种方法检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者外周血结果分析

三种方法检测阵发性睡眠性血红蛋白尿患者外周血结果分析

何秋阳马顺高

何秋阳马顺高

（大理州人民医院检验科云南大理671000）

【摘要】目的：研究用传统方法酸溶血试验、蔗糖溶血试验以及流式细胞术检测红细胞、白细胞上的CD55、CD59对PNH患者外周血检测结果，了解传统方法与流式细胞术检测方法的敏感性和特异性以及对PNH患者诊断的临床应用。方法：用酸溶血试验、蔗糖溶血试验和流式细胞术分别对40例PNH患者和30例健康对照组进行检测，并对三种检测结果进行统计学分析。结果：流式细胞术检测红细胞、白细胞上的CD55、CD59阳性率和蔗糖溶血试验无明显差异（P>0.05），明显高于酸溶血试验（P<0.05），酸溶血试验阳性率明显低于蔗糖溶血试验P<0.05，三种方法分别和对照组相比，P均<0.05，说明三种方法检测PNH组阳性率均明显高于对照组。结论：流式细胞术检测红细胞、白细胞上的CD55、CD59诊断PNH与传统的酸溶血试验和蔗糖溶血试验相比，不仅特异性好，敏感性也好，但技术要求非常高，仪器和试剂成本也较贵，比较适合大医院开展；传统方法:酸溶血试验特异性高敏感性低，蔗糖溶血试验特异性低敏感性高，但两者费用低廉，容易操作，109

联合应用有助于提高PNH患者的诊断，所以非常适合基层医院开展应用。

【关键词】酸溶血试验；蔗糖水溶血试验；阵发性睡眠性血红蛋白尿症；流式细胞术；CD55；CD59

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）04-0034-02

ThreewaystodetectPNHpatientsperipheralbloodanalysisresultsHeQiuyang,MaShungao.DaliprefecturePeople'sHospitalofYunnanProvince,Dali671000,China

【Abstract】ObjectiveResearchinthetraditionalmethodofacidhemolysistest，sucrosehemolysistestandflowcytometrydetectionofredbloodcells，whitebloodcellsofCD55,CD59onperipheralbloodinpatientswithPNHtestresults.MethodsWithacidhemolysistest，sucrosehemolysistestandflowcytometryrespectivelyin40patientswithPNHpatientsand30healthycontrolsweredetected，andthethreetestresultsforstatisticalanalysis.ResultsFlowcytometrydetectionofredbloodcells，whitebloodcellsofCD55，CD59onnodifferencebetweenthepositiverateandsucrosehemolytictest，significantlyhigherthanacidhemolysistest,P>0.05,P<0.05,acidhemolysistestweresignificantlylowerthansucrosehemolytictest,P<0.05,threemethodswerecomparedwithcontrolgroup,P<0.05,suggestingthatpositiverateofthreemethodstodetectPNHgroupweresignificantlyhigherthanthecontrolgroup.ConclusionsFlowcytometrymeasureredbloodcells，whitebloodcellsofCD55，CD59onthediagnosisofPNHwithtraditionalacidcomparedhemolysistestandsucrosehemolytictest,notonlygoodspecificity，sensitivity.

【Keywords】Acidhemolysistest;Sucrosewaterhemolysistest;Matrixflowcytometry;CD55;CD59

阵发性睡眠性血红蛋白尿(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，PNH)是一种后天获得性造血干细胞PIG-A基因缺陷导致糖化磷脂酰肌醇(GPI)合成障碍而引起GPI锚蛋白缺失的慢性溶血性疾患，出现补体介导血管内溶血、静脉血栓形成倾向、全血细胞减少，骨髓造血功能衰竭等临床表现的一种疾病[1]。传统检测方法有酸溶血试验(即Ham试验)、蔗糖溶血试验，随着科学研究的进展，现在PNH已被确认是由造血干细胞异常引起的异常克隆所产生的细胞膜在形态上发生异常[2]。因此检测PNH患者外周血粒细胞和红细胞膜衰变加速因子(CD55)、反应性溶血膜抑制物(CD59)的表达诊断PNH已成为检测的先进方法，本文进一步阐明先进方法与传统方法对PNH与健康对照组的检测结果，探讨PNH诊断的敏感指标，现报告如下。

1.材料与方法

1.1一般资料

收集本院2010年1月—2014年5月门诊及住院PNH患者40例，其中男23例，女17例，年龄16～52岁，年龄中位数34岁；同时选取30名健康体检者作对照，男16人，女14人，年龄21～60岁，年龄中位数41岁，诊断标准参照《血液病诊断及疗效标准》[3]。

1.2仪器与试剂

普通离心机和37℃水浴箱，流式细胞仪:美国Beckman-Coulter公司流式细胞仪(EPICS-XL):主要试剂有PE-CD55，FITC-CD59，pc5-CD45和阴性对照PE-IgG，FITC-IgG，红细胞裂解液。以上试剂均购自美国Beckman-Coulter公司。0.2mmol/L盐酸溶液4℃保存；92.4g/L蔗糖溶液-20℃保存；0.9%生理盐水室温保存。

1.3方法

1.3.1标本采集采集患者静脉血EDTA抗凝2ml、3.8%枸橼酸钠抗凝2ml立即送检。

1.3.2蔗糖溶血试验和酸溶血试验严格按《全国临床检验操作规程》第三版操作[4]。

1.3.3患者EDTA抗凝静脉血2mL，在采血后6h内测定。粒细胞用全血溶血法获得，红细胞采用全血标本，用磷酸盐缓冲液(PBS)调细胞浓度为1×106/mL。设测定管和对照管，测定管内分别加入Pc5-CD45和PE-CD55各10uL，对照管内加入Pc5-CD45和FITC-CD59各10μL。粒细胞测定管加上述悬液100μL，红细胞测定管加20μL全血充分混匀，室温下避光孵育30min。红细胞测定管和其对照管均分别加1mLPBS缓冲液，室温避光孵育30min后，以红细胞裂解液溶血，上机检测。通过荧光散点图和荧光直方图分析粒细胞、红细胞上CD55、CD59的表达，以CD55+或CD59+<95%视为阳性，有临床诊断价值[5]。

1.4统计学处理

采用SPSS19.0统计软件进行统计，各组间比较采用x2检验，P<0.05，有统计学意义。

2.结果

Ham试验检测PNH患者外周血，敏感性为65.0%，特异性为93.3%，蔗糖溶血试验敏感性为95.0%，特异性为76.7%，红细胞、粒细胞CD55和CD59检测敏感性97.5%、特异性96.7%，各种检测方法阳性率分别和对照组比较，P均<0.05，说明有统计学意义，Ham试验分别和其他两组比较P<0.05，说明有统计学意义，Ham试验的阳性率显著低于蔗糖溶血试验和红细胞、粒细胞CD55和CD59阳性组，蔗糖溶血试验组和红细胞、粒细胞CD55和CD59阳性组比较，P>0.05，说明无统计学意义，两组间阳性率无明显差异（见表）。

3.讨论

本作者发现Ham试验对PNH的诊断特异性93.3%，敏感性为65.0%，接近姜丽波等报道敏感性为60%～86%，是临床上确证PNH的主要依据[6]，但仅凭这一项试验确诊PNH是不够的，因为约有10%的PNH患者Ham试验始终阴性[5]。蔗糖溶血试验敏感性虽然高95.0%，但特异性仅为76.7%，除PNH和AA-PNH外，在G6PD缺乏症、MDS和AIHA中均有检出，且阳性率在10%以内[7]，流式细胞术检测PNH患者外周血红细胞、粒细胞CD55和CD59敏感性97.5%和蔗糖溶血试验没有差异，但特异性96.7%却显著高于蔗糖溶血试验，和Han试验比较特异性没有差异，敏感性却高于Ham试验，综合分析三种方法，流式细胞仪检测PNH患者外周血红细胞、粒细胞CD55和CD59敏感性、特异性都非常好，与文献报道一致[1，8]目前，随着流式细胞仪应用，检测糖基磷脂酰肌醇(GPI)缺陷细胞已成为诊断PNH最特异、最敏感且可以定量的最佳方法[1，8]，但昂贵的检测费用和技术要求高等特点使流式检查难以广泛应用。近年来发现GPI缺陷细胞不仅见于PNH病人，许多贫血性疾病都有不同程度的检出[9]，故有必要结合传统检查项目来相互印证。Ham试验、蔗糖水溶血试验两项中连续两次阳性，排除AIHA即可确诊PNH[9]，因此传统项目在临床上仍有重要的地位。加上费用低廉，容易操作，临床上乐意接受，联合应用有助于提高PNH患者的诊断，所以非常适合基层医院开展应用。

【参考文献】

[1]付蓉.阵发性睡眠性血红蛋白尿症现代诊断与治疗[J].中国实用内科杂志，2012，32(5):327-330.

[2]王永才，朱杰，王敏等.CD55、CD59、CD34对AA-PNH早期诊断研究应用[J].实用临床免疫学，2005，21(7):553-556.

[3]张之南，沈悌.血液病诊断及疗效标准[M].第3版.北京:科学出版社，2007.6-55.

[4]叶应妩，王毓三，申子瑜.全国临床检验操作规程[M].第3版.中国人民共和国卫生部医政司，2006：190-191.

[5]王永才，朱杰，王敏等.CD55、CD59、CD34对AA-PNH早期诊断研究应用[J].实用临床免疫学，2005，21(7):553-556.

[6]姜丽波，张波英，韩树林等.CD59检测在PNH诊断中的应用[J].中国中医药讯2010，2(8):194.

[7]肖作淼，余路虎，李志红等.简易“PNH三项”检查对贫血类型鉴别的应用[J].实验与检验医学2013，31(1).

[8]乔伟振，李小雯，谢平等.粒细胞CD59分子缺失表达在PNH特异性诊断指标的价值分析[J].重庆医学，2011，7(40):1991-1994.

[9]王艳，左雅蓓，王玉昭等.阵发性睡眠性血红蛋白尿症的诊治[J].河北医药，2012，34(3):430-432.