乙型肝炎病毒血清学标志物（HBV-M）的检出及应用

乙型肝炎病毒血清学标志物（HBV-M）的检出及应用

赵北光田纳(哈尔滨市红十字中心血站黑龙江哈尔滨

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)20-0268-03

HBV是乙型肝炎的病原体，乙型肝炎患者潜伏期、急性期及乙型肝炎病毒携带者的血液具有高传染性，接触极微量的（10-7～10-6ml）的血液即可引起感染。乙型肝炎危害极大，约10%的乙型肝炎转变为慢性肝炎（CH），部分慢性活动性肝炎（CAH）转变为肝癌（HCC）。婴幼儿感染HBV易形成持续病毒携带者，HBV病毒携带者发生原发性肝癌的危险性更大。而我国又是乙型肝炎高感染国家，据统计，全国人口10%以上为HBsAg携带者，乙型肝炎病毒的总感染率为35.5%～61.1%。由于可进行定量分析，对药物疗效和病情监测都具有重要意义。本实验用三种不同的方法检测了HBV-M，旨在探讨三种方法在日常生活工作中的可行性与相关性。现将实验结果报告如下。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1健康人血清采用TRFIA、MEIA、ELISA对200例健康职工经HBV-M五项指标做定性（量）分析，随机抽取50例作为正常对照，年龄1～45岁。

1.1.2乙型肝炎患者血清用TRFIA、MEIA、ELISA对50例强阳性或临界值血清样本做HBV-M五项指标检测，年龄1/12岁～81岁。

1.1.3质控血清卫生部临检中心质量控制血清浓度分别为：0.2ng/ml，0.5ng/ml，1.0ng/ml，2.0ng/ml,5.0ng/ml；内蒙古临检中心质控血清：0.3ng/ml,1.0ng/ml,2.0ng/ml，5.0ng/ml。

1.2诊断试剂、仪器与方法

1.2.1诊断试剂与仪器TRFIA分析法使用上海新波生物技术有限公司生产的ANYTEST2000型时间分辨荧光免疫检测系统和SYM-BIOBGATE2310全自动微孔洗涤机及配套试剂。MEIA分析法使用美国Abbott试剂和AXSYM全自动酶免发光分析系统；ELISA法使用北京万泰药业公司及3V公司生产的试剂。洗板机为天石医疗用品制作所ZMX-998B型自动酶标洗板机；酶标仪为奥地利CliniBio128C自动酶标仪和SHANDONGGAOMICAIHONGANALYTICALINSTRUMENTSCO.LTD的GF-M2000MICROPLATEREADER。

1.2.2方法TRFIA（Timeresolvedfluoroimmunoassay，时间分辨荧光免疫技术）技术是以镧系元素铕化合物作为荧光标记物，利用这一荧光物质有长荧光寿命的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再进行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效地消除非特异本底荧光的干扰，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。

2结果与分析

2.1TRFIA和ELISA检测定性结果分布得出

HBsAg：灵敏度48/（48+1）×100%=97.96%，特异性50/（50+1）×100%=98.04%，诊断符合率98.00%；同理：HBsAb：灵敏度为93.47%，特异性81.48%，诊断符合率97.00%；HBeAg：灵敏度为96.55%，特异性97.18%，诊断符合率97.00%；HBeAb：灵敏度为90.91%，特异性89.74%，诊断符合率90.00%；HBcAb：灵敏度为95.92%，特异性92.16%,诊断符合率94.00%。

2.2TRFIA和MEIA检测定性结果分布TRFIA和MEIA检测定性结果分布得出

HBsAg灵敏度48/（48+1）×100%=97.95%；特异性51/（51+1）×100%=98.08%；诊断符合率98%；同理：HBsAb：灵敏度为100%，特异性85.45%，诊断符合率92%；HBeAg：灵敏度为96.97%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为95.83%，特异性93.42%，诊断符合率94.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性96.00%，诊断符合率97.00%。

2.3ELISA和MEIA检测定性结果分布ELISA和MEIA检测定性结果分布得出

HBsAg：灵敏度49/（49+0）×100%=100%；特异性51/（51+0）×100%=100%；诊断符合率99.00%；同理：HBsAb：灵敏度为100%，特异性98.18%，诊断符合率99.00%；HBeAg：灵敏度为96.67%，特异性98.57%，诊断符合率98.00%；HBeAb：灵敏度为91.67%，特异性100%，诊断符合率98.00%；HBcAb：灵敏度为98.00%，特异性100%，诊断符合率99.00%。

2.4分析比较

2.4.1当CUTOFF值设置为≥0.3ng/ml时，HBsAg：TRFIA1例阳性，表现为“小三阳”，而ELISA阴性，其浓度为0.4ng/ml，结果仅为HBeAb和HBcAb阳性，提示TRFIA由于相对敏感而检出，而MEIA与TRFIA基本一致。但就临界标本而言，TRFIA、ELISA、MEIA均存在一定的假阳性率、假阴性率分别为1.96%、2.04%。就随机样本而言，ELISA、MEIA则HBsAg较易出假阳性、假阴性反应。实际工作中HBsAg的CUTOFF值设为0.5ng/ml。

2.4.2当CUTOFF值设置为≥0.03NCU/ml时，TRFIA法HBeAg2例阳性，而ELISA阴性，经过综合分析，这2例为真阳性。而MEIA仅有1例阳性，说明三种方法均有一定的漏检TRFIA法测HBeAg灵敏度、特异性、结果符合率就随机样本而言，要高于ELISA、MEIA。因本项目标本所选取大多为强阳性标本，故其灵敏度、特异性、结果符合率基本一致。

2.4.3当CUTOFF值设置为≥10mIU/ml时，HBsAb三种方法均很好，阳性符合率都很高；当CUTOFF值设置为≥1.5NCU/ml时，HBeAb三种方法阳性率也都很高。但就临界标本而言，ELISA和MEIA出现假阳性和假阴性反应要高于TRFIA法且易漏检。

2.4.4当CUTOFF值设置为≥0.095NCU/ml时，HBcAb：TRFIA1例假阳性，ELISA1例假阴性，三者符合率很高。这样（血清标本分别进行20倍、30倍稀释）检测结果基本符合HBV感染后的血清学标志物模式。

2.4.5三种方法阴阳结果经配对资料的卡方检验，差异均无显著性（P＞0.05）。就随机样本而言，三种方法结果符合率都很高，就临界值样本，ELISA和MEIA假阴性、假阳性反应明显高于TRFIA法；灵敏度和特异性普遍低于TRFIA法。究其原因，可能与前两种方法与TRFIA法反应原理不同有密切关系。

3应用

3.1TRFIA定量检测HBV-M（俗称乙型肝炎两对半）临床应用及意义血清乙型肝炎五项标志物定性测定始于80年代中期,对乙型肝炎的疾病诊断,病程监测,疗效观察起到了一定的作用。随着临床医学的迅速发展,定性检测已远远不能满足临床及患者的要求。由于受检测抗原抗体“定性”结果不是“阴性”就是“阳性”,只能作程序式的、机械的判断,对某些结果不能做出合理的解释且存在较大缺陷,无法动态观察病情和疗效变化,为临床所提供的信息有限。随着临床医学检验中新型标记方法的建立(如用镧系元素的原子作为标记物的时间分辨荧光分析技术),乙型肝炎五项病毒指标定量测定成为可能，大大弥补了酶标（ELISA）定性测定的不足之处。

3.1.1TRFIA检测HBsAg灵敏度可达0.0625ng/ml（至少0.2ng/ml），而ELISA检测HBsAg灵敏度是0.5ng/ml（甚至达2ng/ml），也即只有血清中HBsAg的达到0.5ng/ml酶标才会呈阳性。而两对半定量五项指标TRFIA的综合应用较以往定性检查更加灵敏准确。

3.1.2动态观察疗效和病情监测病情的发生、发展、疗效、预后是一个动态变化的过程，定量检测HBV-M各项标志物的浓度变化可对乙型肝炎的病程、治疗、预后能起到一个全程动态检测的作用，能够为医生对病情疗效做出合理的解释提供依据，指导治疗。

3.2TRFIA和定量PCR技术互相补充尽管HBV-DNA定量PCR测定可以直接反映血液中病毒复制状态，具有很多临床应用价值，但并不能完全反映病毒复制静息期肝细胞内HBV病毒状态。HBV-DNA阴性并不能完全代表体内HBV已被清除，结合HBV-M五项指标更能客观反映体内HBV病毒状态，正确判断预后和治疗。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度还较高，提示并未完全痊愈，有可能病毒再次出现复制状况，尚须密切关注。如果HBV-DNA阴性而HBsAg、HBeAg或HBeAb及HBcAb浓度均很低或阴性并持续一段时间，提示可能完全痊愈，预后效果良好。乙型肝炎患者进行抗病毒治疗时，血清中的病毒核酸含量是反映病毒数量和复制活跃程度的最可靠的直接指标，因此，病毒含量的检测显得必不可少，是能确实反映动态观察药物疗效的确切指标，特别是对于HBeAg阴性的患者。但长期应用贺普丁治疗HBV-DNA阳性的患者必须应用PCR来测定是否产生YMDD变异，但采用测序方法操作繁琐而且成本高，不宜广泛应用。应用YIDD、YVDD特异酶切位点PCR技术，可准确检出血清中的YIDD及YVDD变异，与测序结果完全相同，该方法成本低，适合临床用于监控抗病毒治疗。PCR方法具有敏感性高，可检测出极微量的核酸，但不同的检测系统的敏感性即检测的最低病毒核酸量仍有差异，理论上能检出一个拷贝的基因，因存在操作技术等方面的影响，其实际敏感性一般在几百个copies/ml左右，由于影响其测定的因数颇多，常易出现假阳性和假阴性结果，因此必须据临床上其他检（监）测资料，进行综合分析。一般HBeAg、HBV-DNA为病毒复制指标，HBsAg、HbeAg、HBcAb为病毒感染指标，当HBeAg、HBV-DNA均为阳性时，证明病毒复制活跃，传染性强，应采取积极治疗。当HBsAg、HBeAb、HBcAb均为阳性，为病毒性肝炎恢复期，此时病毒复制虽不活跃，但HBV-DNA检测仍为阳性，说明病毒依然存在，也应采取治疗，以提高免疫抗病毒治疗为主；而当HBV-DNA检测为阴性时，为恢复期，当各种指标证明人体内病毒已得到抑制，可以不用治疗；属于既往感染HBV并且现有保护性抗体HBsAb的确存在及HBV-DNA阴性时，说明已趋于好转和（或）临床治愈，可不用药。在我国感染HBV人群基因型中存在B型、C型之分，因此感染HBV后不同HBV型与宿主作用的结果就有不同。因而HBV-M表达结果就有多种情况出现。而目前，还不知道能否用病毒核酸含量作为病毒滴度的替代指标，评估传播危险，血浆病毒核酸含量只能反映外周血中细胞外病毒水平，不能反映血细胞和机体其他组织内病毒的含量。虽然较低病毒核酸含量可能提示较低滴度的暴露，但是并不能排除传播的可能，已有血浆病毒核酸含量低于检测限的病例发生母婴传播和导致正常人员职业感染的报道，职业暴露人员的免疫反应也是影响传播的因素之一。因而，分析HBV感染者的病情状况和病毒复制状态和病毒变异程度以及职业暴露和传播风险评估时，不能光靠HBV-M，有必要结合HBV-DNA、HBV-M定量同时判定。

3.3HBsAb的定量测定能够对抗体是否真正具有“中和”HBV的免疫力作出正确的评价，对乙型肝炎的预防起到监督作用。

做定量检测，可据HBsAb的含量判断机体对HBV的免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果。HBsAb的含量在10mIU/ml以上病人在用ELISA或MEIA检测就可呈“阳性”结果，但并不提示机体一定具有免疫力，而HBsAb的含量在10～100mIU/ml之间的样本定性为“阳性”，定性虽为“阳性”，但此时机体对HBV的免疫力较弱，甚至不能预防HBV感染，仍有感染HBV的危险。只有HBsAb的含量达100mIU/ml以上（或更高）时才可确定具有抵抗(同型)HBV入侵的作用。但也有例外，人们发现的许多HBV变异株，S基因的突变，会使乙型肝炎疫苗诱导的人体产生HBsAb的无效。HBsAb的含量越高，机体抵抗HBV入侵的能力越强，持续保护的时间越长。做定量测定，根据HBsAb的含量可判断机体对HBV免疫状态及乙型肝炎疫苗的免疫效果，HBsAb的含量较低，应该进行NID（即强化免疫，加强注射乙型肝炎疫苗），使HBsAb的浓度提高到保护作用。同时，乙型肝炎疫苗接种后机体产生免疫力因个体差异而不同，有的可产生高浓度的并持续数十年。而有的人产生的抗体浓度不是很高，且持续时间也不长，数年后就逐渐消失，这部分人应及时关注HBsAb浓度的变化，必要时也应进行NID（但也有人认为机体在受到病毒感染时，会产生记忆反应，迅速提高免疫力），否则，仍有可能感染HBV。因此定量测定HBsAb对乙型肝炎疫苗免疫力的评价和高危人群及职业暴露者预防免疫、免疫防疫都具有重要意义，尤其在少年儿童预防乙型肝炎方面。

在慢性肝病的治疗过程中，病人对了解自己病情的变化尤为关切。定量测定乙型肝炎血清标志物的浓度使病人能够对自己的病情有更清楚的了解，提高治疗信心，同时也加强对医生的信任度，有助于改善医患关系，利于疾病治疗。

综上所述，TRFIA技术作为一种灵敏度高，特异性及重复性好的无污染定量免疫测定方法，有着广泛的应用前景，随着社会经济的发展，应用各种非放射免疫标记、非发色酶标的自动化设备进行分析是检测技术发展的必然趋势，相信TRFIA技术在实验室将得到普及而且应用范围会越来越广。