制作高质量带牙颌骨组织病理切片方法探讨

制作高质量带牙颌骨组织病理切片方法探讨

李海瑛

岳阳县人民医院湖南岳阳414100

【摘要】目的：简单的介绍制作高质量带牙颌骨组织病理切片方法。方法：取得三个犬带牙颌骨，每个1取5块组织。结果：比较传统的脱钙方法、改良脱钙方法，氯仿溶液进行脱水、采用正丁醇作为透明剂进行组织多级酒精脱水，石蜡包埋、塑料包埋技术。结果：获得的组织切片质量高，检查效果较好，镜下组织结构清晰。同时切片切取的动作流畅。获得30μm左右的骨磨片，1μm厚的切片。染色可清晰显示牙与骨组织结合部，以及胶原纤维、类骨质。结论：改良脱钙方法→正丁醇作为透明剂透明剂进行脱水→塑料包埋，切片质量高、难度小，获得切片组织成像效果好。

【关键词】牙齿；颌骨；病理切片

组织病理切片是进行肿瘤诊断、分期额重要步骤，临床上对于软组织病理切片技术基本成熟。但对于质地较硬的组织，如颌骨、牙病例切片则较困难。对于颌骨肿瘤而言，进行带牙的组织病理切片，容易出现脱钙不彻底、脱水不完全等情况，从而影响病理切片的效果，最终导致无法有效分析牙周组织关系、骨诱导再生等病理情况，影响切片分析的价值[1]。本文的简单的介绍制作高质量带牙颌骨组织病理切片方法。

1材料与方法

1.1实验材料

犬（杂交犬为主，犬种不限）带牙下颌骨，颊舌向，4.2×1.0cm×0.5cm。犬拔牙后下颌骨，颊舌向，4.0×1.5cm×0.3cm。犬胫骨，1.5cm×1.3cm×0.5cm，各取5块标本。

1.2仪器与试剂

主要包括多聚甲醛、乙二胺四乙酸、氢氧化钠、浓盐酸，苦味酸，苏木素染液，中性EDTA脱钙液（1750ml蒸馏水±25gNaOh＋250gEDTA）等。恒温冷冻石蜡切片机，电子天平，冷冻包埋机等。

1.3方法

1.3.1脱钙方法

骨组织脱钙方法较多，包括单酸脱钙以及复合酸脱钙，对于不进行免疫组检查的标本，应以提高成像质量为主要目标脱钙。我们尝试比较传统的脱钙方法，即将股块放入10%硝酸浸泡脱钙。另一种采用改良脱钙方法，即先采用40%甲醛＋95%乙醇，按照1：9浓度进行配比，制得到200ml混合液，放置在烧杯中，然后加入20ml68%硝酸，混匀后，值得混合的脱钙液。将取得的骨组织样本，加入混合液之中，加盖，50-60℃恒温箱中加热处理，持续10-12h。检查是否脱钙完全，若标本可轻度完全，同时细针插入试验理想，刀片可轻易切割，则认为脱钙比较理想。结果改良脱钙法更为理想。

1.3.2脱水方法

对于组织脱水，我们比较了两种脱水方法，第一采用氯仿溶液进行脱水，经酒精、二甲苯透明以及浸蜡处理，石蜡包埋。主要步骤：75％乙醇30min；85％乙醇1h；95％乙醇1h；100%乙醇、100％乙醇、100％乙醇各1h；50％乙醇＋50％二甲苯30min；二甲苯I30min；二甲苯II30min；50％石蜡＋50％二甲苯30min；石蜡I30min；石蜡II30min。随时观察溶液的浑浊程度，并及时更换石蜡以及试剂。另外一种是采用正丁醇作为透明剂，进行组织多级酒精脱水，石蜡包埋。结果显示，正丁醇作为透明剂透明剂进行脱水处理效果较好。

1.3.3包埋方法

一种方法即采用传统的石蜡包埋，另一种采用塑料技术。石蜡包埋：在包埋机与冷台上进行组织石蜡包埋，包埋时组织切面需要与包埋盒底平行，在冷台上冷却20min，修理多余的石蜡。摊片机水槽中加入自来水，温度40℃，塑料包埋盒固定在切片机，调整刀片，转动手柄进行切块，进行展片、捞片、烤片。改良塑料包埋技术：配置浸润液，浸润液Ⅰ甲基丙烯酸甲酯与领苯二甲酸二丁酯3：1比例混合，磁力搅拌2h。浸液Ⅱ：甲基丙烯酸甲酯与领苯二甲酸二丁酯3：1比例混合，每100ml加入过氧化苯甲酰1.5g，磁力搅拌4h。浸液：甲基丙烯酸甲酯与领苯二甲酸二丁酯3：1比例混合，每100ml加入过氧化苯甲酰4.0g，磁力搅拌4h。组织脱水透明后，浸液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各2日，每日抽真空4h，以利于浸液体渗入到阻滞深部。然后进行包埋，配置溶液Ⅲ倒入青霉素瓶，放入组织快，加盖，温室过夜，第2日38℃烤箱2-3日，取出，放入冰箱切片，砸碎瓶子，取出组织快，切片。石蜡研磨。最后，显示采用塑料包埋，切片观察效果更理想。

1.4评价

对不同的处理措施下的脱钙、脱水方法、包埋处理结果，由2名病理师分别独立评价。

2结果

本文最终选择改良脱钙方法→正丁醇作为透明剂透明剂进行脱水→塑料包埋，结果显示获得的组织检查效果较好，镜下组织结构清晰。同时切片切取的动作流畅。获得30μm左右的骨磨片，1μm厚的切片。染色可清晰显示牙与骨组织结合部，以及胶原纤维、类骨质。具体评价结果如下表1。

表1不同脱钙、脱水、包埋处理样本效果评价

3讨论

骨组织脱钙处理是制作切片最常用的切片。但骨组织中有大量的钙盐，制片难度较大。传统的脱钙处理的耗时比较长，短则36-72h，长则1-2个月，严重影响脱钙的效率与制片的质量。传统的脱钙方法，也容易导致骨组织结构、形态、免疫抗原受损，从而影响病理诊断的结果。同时传统的脱钙方法，切片厚度往往在5μm以上，容易因为染色脱落。本文采用甲醛、乙醇、浓硝酸制得脱钙液，不同于传统的脱钙，能够有效的骨组织免收酸破坏，同时达到较好的脱水效果。脱水过程中50～60℃的热处理，可促进骨组织分子运动，利于硝酸根离子与组织中的钙离子结合，从而达到理想的脱钙效果[2-3]。

对于组织脱水，可供选择的方法较多，本文对比了采用氯仿溶液进行脱水、正丁醇作为透明剂进行组织多级酒精脱水，结果显示后者脱水处理效果较好。传统的脱水透明处理，时间不容易掌握，同时二甲苯脱水的力量比较大，容易导致脱水过渡，导致组织干脆，变硬。二甲苯是一种有毒制剂，对工作人员的健康影响较大。氯仿有较好的脱水透明效果，但对于皮质骨含量较多的骨组织，浸透效果不理想，且有挥发性，采购难度较大。正丁醇是一种无色液体，脱水能力较弱，但与乙醇、水混合后，脱水效果明显提高，正丁醇能够软化组织，时间控制难度小，性质柔和，不易产生变形情况，无收缩[4]。

对于包埋与切片，目前普遍采用石蜡切片，该法的缺陷是无法制得磨片，不适合进行荧光检查。采用塑料包埋技术，能够获得更理性的切片，获得30μm左右的骨磨片，成像质量好，可观察胶原纤维、类骨质等组织。需注意的是，对骨组织进行塑料包埋处理，脱水必须充分，特别表示95%乙醇的处理时间需要足够长，否则容易导致组织块中出现大量的气泡，从而影响切片与染色。采用正丁醇脱水，性质柔和，透明时间长，但不易导致组织变硬、脆情况，有助于组织切片。另外还需注意的是，塑料包埋剂有一定的亲水性，长时间水中研磨，可能导致切片与载物片容易分离，导致组织脱落，所以制作磨片最好采用石蜡油[5]。

小结：

本文最终选择改良脱钙方法→正丁醇作为透明剂透明剂进行脱水→塑料包埋，结果显示获得的组织检查效果较好，镜下组织结构清晰。

参考文献：

[1]刘增辉主编.病理染色技术[M].北京.人民卫生出版社：2000：2-4.

[2]YoshidaT，SternPH.HowvitaminDworksonbone[J].EndocrinolMetabClinNorthAm，2012，41（3）：556-569.

[3]万蕾，章锦才，轩东英，等.不同脱钙方式观察牙髓组织切片的效果比较[J].广东医学，2012，33（7）：917-919.

[4]夏朝霞.改良骨髓脱钙液对免疫组化染色结果的影响[J].现代实用医学，2014，26（8）：1002-1003.

[5]MattiatoponlosL.，RodriguezA，Dieporter.D.A，etal.Animpmvcdmethodforpreparinghistologicalsectionsofmetallicimplants[J].JmrJOralMaxillotacimplants，1986，1（1）：31-37.