大鼠慢性移植肾病中自身免疫损害的强度评估

大鼠慢性移植肾病中自身免疫损害的强度评估

肖显杰梅智强万卉杨清陈慧敏刘立方成

肖显杰梅智强万卉杨清陈慧敏刘立方成

（武汉轻工大学医学院移植免疫实验室430023）

【摘要】目的：测量与评估大鼠慢性移植肾病中自身免疫反应的致病强度。方法：使用F344、Lewis大鼠分别为供受体建立经典慢性移植肾肾病模型(CAN组)。改良CAN模型保留受体一侧自体健肾建立自体肾损害观测模型（AI组）。使用正常Lewis大鼠建立肾单纯缺血再灌注模型（IR组）。以Lewis大鼠肾缺血再灌注并同系CAN大鼠脾细胞过继模型为AR组。以Lewis大鼠自体肾移植作为对照（Syn组）。动态监测各组模型生存曲线、蛋白尿水平动态变化。40周检测自体肾肾小球硬化指数（GSI）。结果：CAN组蛋白尿水平在肾移植后第6周开始上升，第32周上升至(1.72±0.06)g/mmol。其存活率第57天为85.7%，第94天为42.9%，至260天为0。AI和IR组蛋白尿水平至40周维持正常（<0.05g/mmol）。而AR组在第18周出现蛋白尿水平异常（0.18±0.03)g/mmol，其后持续缓慢上升至40周为（0.23±0.04）g/mmol。该组第97天存活率为80%保持至第280天。第40周检查AR组自体肾GSI为（1.24±0.16）。结论：大鼠肾移植继发自身免疫40周致肾功能轻度异常，但肾小球硬化面积已达25%。

【关键词】慢性移植肾病自身免疫病理

【中图分类号】R692【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）11-0092-02

Evaluatingtheautoimmunedamagesinchronicallograftnephropathyofrats

XIAOXian-Jie,MEIZhi-Qiang,WANHui,YANGQing,CHENHui-Min,LIULi,FANGCheng.

LaboratoryofTransplantImmunology,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China

【Abstract】Objective:Tomeasureandevaluatethepathogenicstrengthofautoimmunereactioninchronicrenalallograftnephropathyofrats.Methods:LewisrecipientswithaF344allograftwassetupastheclassicchronicallograftnephropathymodel(CANgroup).ImprovedCANmodelwhichthereceptorsretainothersideofautologouskidneyservedasautologousrenaldamagesmodel(AIgroup).Renalischemia-reperfusionmodel(IRgroup)wasestablishedusingnormalrats.Lewisratswithrenalischemia-reperfusionandadoptionofsplenocytesfromsyngenicCANratsservedasARgroup.Syngenicrenaltransplantsactedasthecontrols(Syngroup).DynamicmonitoredthesurvivalcurveandproteinuriachangesofallmodelsandDetectedautologousrenalglomerulosclerosisindex(GSI)in40w.Results:After6weekstheproteinuriaofCANgroupbeganincreasingandthendevelopedthatreach(1.72±0.06)g/mmolatthe32thweek,whosesurvivalratewas85.7%inthe57thday,42.9%inthe94thday,andzerointhe260thday.TheproteinuriaofgroupAIandIRhadmaintainedthenormallevel(<0.05g/mmol)tothe40thweek.After18weekstheproteinuriaofgroupARbeganincreasingto(0.18±0.03)g/mmolandthendevelopedslowlythatreach(0.23±0.04)g/mmolatthe40thweek.Itssurvivalratewas80%inthe97thdayandheldontothe280thday.TheautologousrenalGSIofARgroupwas(1.24±0.16)detectedin40thweek.Conclusion:Subsequentautoimmunityfollowingrenaltransplantationinratscausedmildabnormalityofrenalfunctionalin40weeksbuttheratioofglomerularsclerosisareacouldreach25%.

【Keywords】chronicallograftnephropathyautoimmunitypathology

慢性排斥免疫损害是同种移植物失功的主要原因，但是在同种移植的病人中，还存在针对自身抗原的免疫反应[1]。前期发现肾移植继发自身免疫病理具有组织损伤依赖性。在异体排斥引起组织损伤基础上，同种肾移植继发的自身免疫可以发展出致病性[2]。但这种自身免疫反应在慢性移植肾病（CAN）中所导致的损害强度尚无测评。本研究使用甄别CAN病程中自身免疫反应的模型，监测其生存曲线和蛋白尿水平并与CAN模型比较，并在观察期末（40周）做肾脏病理检测，全面评估大鼠慢性移植肾病中自身免疫损害的强度。

1材料与方法

1.1动物及试剂

近交系F344（RT11vl）和近交系Lewis（RT11）雄性清洁级大鼠，12-15周龄，体质量220-250g，由北京维通利华实验动物技术公司提供(许可证号SCXK京2006-0009)，20-24℃/12h光照条件标准鼠粮饲养。实验过程遵循中华人民共和国科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2大鼠肾移植模型及分组Lewis大鼠左肾被F344大鼠供肾取代，7d后行右侧肾切除术，受体不使用免疫治疗长期存活，建立经典CAN模型[3]（n=7）。改良CAN模型，保留受体大鼠右侧自体肾；术后7d探查左侧移植肾，确定血供正常、输尿管通畅，建立自体肾损害（Autoimmuneinjury,AI）观察组（n=3）。正常Lewis大鼠切除左肾，右侧肾蒂阻断45min[4]，建立单纯缺血再灌注（Ischemiareperfusion,IR）组（n=3）。在IR建模程序基础上，另经下腔静脉输注同系CAN大鼠脾细胞（5×107）悬液1ml，建立自身免疫过继并自体肾缺血再灌注（AI+IR,AR）组（n=4）。Lewis大鼠自体肾移植（Syngenictransplant）作为对照（Syn组，n=3）。

1.3脾细胞悬液的制备无菌收获大鼠脾脏，将脾脏研磨通过200目不锈钢滤网。裂解红细胞后，有核细胞以PBS清洗两次，细胞重悬于PBS溶液。台盼蓝拒染法计数，活细胞>95％。脾细胞悬液4℃保存，1小时内输注受体。

1.4蛋白尿指标检测受体代谢笼内禁食可随意饮水，收集24h尿液。尿总蛋白浓度（g/L）以考马斯亮蓝法，尿肌酐浓度（mmol/L）以苦味酸法，使用Aeroset全自动生化分析仪（Abbott公司）测定。尿蛋白（Proteinuria）指标依照以下公式计算[5]：蛋白尿（g/mmol）=尿蛋白（g/L）/尿肌酐（mmol/L）。

1.5肾脏组织学检测大鼠肾脏以4%甲醛固定，石蜡切片行HE染色，肾小球出现毛细血管袢皱缩、塌陷和闭塞为肾小球硬化。根据硬化面积占单个肾小球比例进行评分，无硬化改变为0分，硬化面积≤25%、≤50%、≤75%、＞75%分别计1、2、3、4分。随机观测25个肾小球，计算平均数为肾小球硬化指数（Glomerulosclerosisindex,GSI）[6]。

1.6统计分析统计分析使用Prism4.00软件（GraphPadSoftware）。生存曲线分析使用Kaplan-Meier检测。多组间数据比较使用方差分析，辅以指定两组间秩和检验。P<0.05具有显著性差异，使用双侧比较。

2结果

2.1生存曲线分析

自体肾损害观察组（AI组）、单纯缺血再灌注组（IR组）以及自体肾移植组（Syn组）在实验观察期内生存状态良好，存活率为100%。而CAN组大鼠在第57天存活率为85.7%，第94天为42.9%，第205天为28.6%，第260天为0%。自身免疫过继并缺血再灌注组（AR组）大鼠在第97天存活率为80%并维持至第280天（图1）。AR组与CAN组或Syn组间生存曲线具有显著性差异（P<0.01）。

2.2蛋白尿时间曲线

正常大鼠及Syn组蛋白尿水平（g/mmol）稳定于（0.03-0.05）。CAN组蛋白尿水平第2周为（0.21±0.07），第4周为（0.15±0.04）。第6周（0.28±0.16）明显上升，其变化具有显著性（P<0.01)，提示肾功能损害。第18周为(0.47±0.10)，第24周为(1.15±0.22)，第32周上升至(1.72±0.06)。AI组和IR组观察蛋白尿至40周，未出现持续肾功能异常(proteinuria<0.05g/mmol)。AR组蛋白尿水平在2-12周无明显变化，14周(0.07±0.01)后开始缓慢持续上升，第18周和第24周分别为(0.18±0.03)、(0.17±0.03)，第32周蛋白尿水平升高至(0.22±0.02)，观测至第40周为(0.23±0.04)。AR组与CAN组或Syn组间蛋白尿变化曲线具有显著性差异(P<0.01)。

2.3肾小球硬化指数

AI组40周时同种移植肾已极度萎缩硬化。同时收获AI组、IR组及Syn组自体肾均未见肾小球硬化。但AR组自体肾发生广泛肾小球硬化(GSI为1.24±0.16)及局部细胞浸润。依据GSI分级方法AR组自体肾肾小球硬化面积已超过25%。

3讨论

慢性移植肾病（CAN）是导致移植肾功能减退和丧失，使受体再次面临生命威胁[7]。慢性移植肾病的临床表现为进行性肾功能减退、蛋白尿和高血压，最终肾功能衰竭。急性排斥反应、慢性排斥反应、原有肾病复发、缺血再灌注损伤等作为慢性移植肾肾病的高风险因素受到关注。肾移植后继发自身免疫反应的现象不容忽视，这种自身免疫限定为移植后新发的自身免疫反应，而非复发的自身免疫疾病[1,8-10]。前期研究中已经设计模型甄别这种继发自身免疫导致的移植肾损害[2]。

CAN组蛋白尿水平在2-4周维持于（0.15-0.20）g/mmol，6周后持续上升，第18周和第24周分别为（0.47±0.10）、（1.15±0.22）g/mmol，第32周上升至（1.72±0.06）。而AR组蛋白尿水平在第2-12周变化不明显，在第14周（0.07±0.01）后开始持续缓慢上升，第18周和第24周分别为（0.18±0.03）、（0.17±0.03），至第32周蛋白尿水平为（0.22±0.02）。Syn组大鼠蛋白尿保持正常（0.03-0.05）。AR组与CAN组或Syn组间蛋白尿变化曲线具有显著性差异。CAN组大鼠在第57天存活率为85.7%，第94天为42.9%，第260天为0%；AR组在第97天存活率为80%，持续至第280天；而Syn组大鼠观察期存活率为100%。AR组与CAN组或Syn组间生存曲线具有显著性差异。可以发现肾移植继发自身免疫导致的肾功能损伤进程相对CAN较缓，同期生存率较高。但280天AR组自体肾肾小球硬化面积已达25%。自身免疫导致的肾小球硬化及抗体沉积，通常会加速肾功能损害[5,11]，随着移植肾存活时间的延长，自身免疫肾脏损害强度将快速增强。

图1AR组与CAN组的生存曲线图2AR组与CAN组的蛋白尿时间曲线

参考文献

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[3]方成,刘立,胡汉宁,等.大鼠双侧供肾左侧原位肾移植模型的建立及肾功能监测[J].中国组织工程研究与临床康复,2010,14(53):9933-9936.

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基金项目

①湖北省教育厅科研计划项目(Q20121808)

②国家大学生创新创业训练计划项目（201310496004）