荧光定量PCR检测乙肝DNA分析前质量控制

荧光定量PCR检测乙肝DNA分析前质量控制

关玲英

关玲英

（新疆维吾尔自治区人民医院临检中心新疆乌鲁木齐830001）

【摘要】目的:探讨荧光定量PCR检测乙肝DNA分析前质量控制措施。方法:选取本院收治的25例乙肝两对半检测确诊为乙肝大三阳患者的血液,每个患者的血液平均分为A、B、C、D组，A组即刻测定，B组室温放置2天测定，C组4℃放置7天测定，D组溶血即刻测定，比较不同的储存时间、温度以及标本是否溶血对乙肝病毒DNA进行荧光定量测量结果的影响。结果：未溶血标本与溶血标本相比以及不同储存时间和温度相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：标本溶血、储存时间以及温度对荧光定量PCR检测乙肝大三阳血清标本DNA的结果无影响。

【关键词】荧光定量PCR；乙肝DNA；分析前质量控制

【中图分类号】R575【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）10-0037-02

QualitycontrolbeforeanalysisoffluorescencequantitativePCRdetectingHBV-DNAGuanLingying.

TheXinjiangUygurAutonomousRegionPeople'sHospital,Xinjiang,Urumqi830001,China

【Abstract】ObjectiveToinvestigatethemeasureofQualitycontrolbeforeanalysisoffluorescencequantitativePCRdetectingHBV-DNA.MethodsSelectourhospital25casesofpatientsdiagnosedwithhepatitisBpositiveblood,thebloodofeachpatientwerepidedintoA,B,C,Dgroups.Agroupimmediatelydetermined,groupBatroomtemperaturefor2daysbeforedetermination,groupCat4℃for7daysbeforemeasured,Dhemolyticgroupmeasuredimmediately.Comparewhetherdifferentstoragetime,temperatureandtheeffectofsamplehemolysisaffectthemeasurementsoffluorescencequantitativeHBV-DNA.ResultsNohemolysiscomparedwithhemolysis,differentstoragetimeandtemperaturecomparedwitheachother,thedifferencewasnotstatisticallysignificant(P＞0.05).ConclusionHemolysis,storagetimeandtemperaturehavenoeffectonthefluorescencequantitativePCRanalysisofDNAsamplesofserumhepatitisBpatients.

【Keywords】FluorescencequantitativePCR;HBV-DNA;Qualitycontrolbeforeanalysis

乙型肝炎病毒是一种嗜肝性病毒，不仅能引起肝脏疾病，还会侵犯其他器官组织[1]。本研究分析标本溶血、储存时间以及温度对乙肝大三阳血清标本DNA荧光定量PCR检测结果的影响。现报告如下。

1.资料与方法

1.1研究对象

选取本院收治的25例乙肝两对半检测确诊为乙肝大三阳患者的血液，并将每个患者的血液平均分装于四支试管中。三支试管中的血液直接进行血清的制备，然后分为即刻检测（A组），室温放置48h后检测（B组），4℃放置7天后检测（C组）；另一支试管通过震荡制备溶血血清，即刻检测（D组），溶血程度通过用血液分析仪测定血红蛋白量获得。

1.2方法

将A、B、C、D组血清按照既定方法进行检测，每份血清标本均制成模版，按照荧光定量PCR检测的说明书进行操作，定量检测乙肝病毒DNA。其中，血红蛋白测定用日本SysmesK6000血液分析仪，实时荧光定量PCR检测系统为美国产MJRESEARCH实时荧光基因扩增诊断仪，HBV-DNA荧光定量试剂盒来自深圳匹基生物技术开发有限公司。

1.3观察指标

（1）比较溶血标本对乙肝病毒DNA含量测定的影响；

（2）比较不同储存时间和温度对乙肝病毒DNA含量测定的影响。

1.4统计学处理

采用SPSS18.0软件进行数据统计处理。数据以x-±s表示，两组间计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1比较溶血标本对乙肝病毒DNA含量测定的影响

血红蛋白量反应了溶血标本的溶血程度，Hb<2g/L表示标本未发生溶血，本研究中D组（溶血组）所有标本测得Hb＞2g/L，A组（对照组）和D组（溶血组）乙肝病毒DNA荧光定量结果相比，差异无统计学意义（P＞0.05），统计结果见表。

表A组（对照组）和D组（溶血组）乙肝病毒DNA荧光定量结果的比

2.2比较不同储存时间和温度对乙肝病毒DNA含量测定的影响

B组（室温放置48h）、C组（4℃放置7天）乙肝病毒DNA的荧光定量结果与A组（即刻检测）相比，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

3.讨论

在乙肝的治疗过程中，准确测定乙肝病毒DNA的含量[3]能够更好的把握乙肝病毒DNA的复制，能够对乙肝的治疗实时监测，对患者的生活质量有明显的优势。目前，荧光定量PCR已经广泛应用于临床测定乙肝病毒DNA的含量，但是由于基因诊断操作较为复杂以及检测手段的高灵敏度需要有较高的质量控制[2]。临床检验质量的好坏直接关系到疾病的诊疗水平和预防保健工作。质量控制包括分析前、分析中、分析后三个阶段，每一个阶段都是非常重要的，本文主要研究了分析前阶段。

本研究主要分析了标本溶血、储存时间以及温度对乙肝大三阳血清标本DNA荧光定量PCR检测结果的影响。其中，日常临床生化工作中经常遇到的一种现象就是标本溶血，标本溶血后红细胞遭到了破坏，白细胞、血小板等血细胞破坏所释放的某些细胞内成分也可影响临床生化指标的测定。理论上，溶血血清标本细胞内的基因组DNA释放到血清中将一定程度提高检测的结果，但从本研究实验结果可以看出，溶血标本对乙肝病毒DNA定量测定结果没有影响。考虑到本研究结果的原因，可能是高速离心后去掉上层清液使得血红蛋白等干扰物质大量减少，因此，溶血标本对乙肝病毒DNA的荧光定量PCR检测没有影响；或者是标本中的血红蛋白变性沉淀了，离心后标本的上清液中没有血红蛋白的存在。

DNA本身具有的不稳定性要求DNA标本采集后尽快进行检测，不宜放置时间过长，若需长期保存，则放入-80℃冰箱，短期内检测的，放置在4℃冰箱保存[3]。本研究结果4℃保存7天和室温保存2天的血清标本荧光定量PCR测定乙肝病毒DNA的结果与即刻测定的结果无显著性差异。这说明标本不同的储存时间和温度对乙肝病毒DNA定量测定结果没有影响，对临床上荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA有一定的指导意义，但这只能说明在一定的温度和时间内不同的储存时间和温度对乙肝病毒DNA定量测定结果没有影响，超出一定的范围，可能会对乙肝病毒DNA定量测定结果产生很大的影响。

【参考文献】

[1]魏颖.实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素.求医问药(下半月),2012(12):373.

[2]王铁兵等.深圳市隐匿性乙型肝炎病毒感染现状和感染因素分析.中国公共卫生管理,2013(01):58-60.

[3]蔡春林等.2009年深圳市外来劳务工血清乙肝标志物与HBV-DNA的检测分析.实用预防医学,2011(01):47-49.