复方肺积散逆转肺癌细胞免疫逃逸的机制探讨

复方肺积散逆转肺癌细胞免疫逃逸的机制探讨

马宝柱刘洪星姜家康

复方肺积散逆转肺癌细胞免疫逃逸的机制探讨

马宝柱刘洪星姜家康（黑龙江中医药大学黑龙江哈尔滨150040）

【中图分类号】R331【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2009)04-0205-01

【摘要】目的探讨复方肺积散影响肿瘤细胞凋亡机制的作用途径，进而明确该药治疗肺癌的确切机制。方法将40只lewis肺癌小鼠随机分为4组，分别给予不同处理，应用免疫组化法比较观察Fas/FasL和VEGF在各组中的表达。结果复方肺积散可影响荷瘤小鼠Fas/FasL蛋白和抑制VEGF的表达，对肺癌细胞的免疫逃逸呈抑制作用。结论复方肺积散具有良好的抗肿瘤作用。

【关键词】复方肺积散；lewis肺癌；免疫组化法；Fas/FasL；VEGF；

1材料与方法

1.1动物C57BL/6N小鼠60只，雄性，6周龄，体重18～22g。

1.2瘤株Lewis肺癌荷瘤小鼠

1.3药物复方肺积汤方由太子参等15味中药组成；

1.4主要试剂和仪器设备：医用超净工作台等。

1.5Lewis肺癌动物模型的建立处死Lewis肺癌荷瘤小鼠，放入75%酒精浸泡消毒10min，在超净工作台上分离瘤体，取生长良好、无坏死的肿瘤组织，用生理盐水洗净后剪碎，再加生理盐水研磨，过300目尼龙网制成单细胞悬液，台盼蓝（tryan-blue）染色试验计算后细胞数>95%，调整瘤细胞悬液浓度为1×107瘤细胞/mL。选C57BL/6N小鼠，体重18～22g，于每只小鼠右侧腋窝皮下接种肺癌瘤细胞悬液0.2ml，制作成lewis肺癌模型。

1.6分组及给药随机分组肺癌小鼠在瘤株接种后1周成瘤，随即分组；肿瘤对照组15只，每日用0.2ml生理盐水灌胃，连续14d；化疗组15只，腹腔注射顺铂（DDP）1mg/kg，隔日一次，共7次；中药组15只，每日一次喂饲中药35g/kg，共给药14d；中药加化疗组15只，每日一次灌饲中药35g/kg，并隔日一次腹腔注射顺铂1mg/kg，共给药14d。

1.7观察指标与测定方法

1．7．1用免疫组化法检测Fas/FasL表达采用免疫组化SP法严格按试剂盒说明书操作检测Fas/FasL蛋白表达。阴性对照用PBS代替一抗,已知FasL阳性的皮肤癌组织切片用作阳性对照。凡细胞浆和或细胞膜显示棕黄色颗粒者为Fas/FasL蛋白染色阳性。每张切片在400倍光镜下顺序找10个视野,计数细胞总数和Fas/FasL蛋白阳性表达细胞数,计算出每张切片上Fas/FasL蛋白阳性表达的百分数。癌巢或瘤团周边区细胞直径3倍范围定义为周边区,肿瘤或癌巢、瘤团中心定义为非周边区。

1.7.2免疫组化法检测相关蛋白分子VEGF表达再严格按说明书操作,测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达情况。肿瘤组织VEGF表达利用非生物素二步法免疫组化染色;以PBS代替一抗作为阴性对照。VEGF蛋白表达阳性判断标准综合文献的报道A：染色强度:阴性0分，浅棕色1分，棕黄色2分，深棕黄色3分；B：阳性细胞比例：1/3以下为1分,1/3～2/3为2分,2/3以上为3分。积分数=A×B，其中A×B=0为阴性；A×B=1～4分为弱阳性；A×B>4分为强阳性，高表达。

2结果

表1：复方肺积散对肿瘤组织Fas/FasL蛋白表达影响

组别n（始/终）Fas(%)FasL(%)

肿瘤对照组15/1355.53±11.8966.13±18.32

化疗组15/1461.32±10.39#60.24±16.78＃

中药组15/1360.18±9.94#60.85±16.45＃

中药加化疗组15/1565.27±10.47#58.79±18.52＃

注：＃为与对照组比较P<0.05。

表格显示：对照组肿瘤组织的Fas的表达低于各用药组，其FasL比较则高于各用药组{P<0.05}，其余各组间两两比较也有差异，但差异不明显。

表2：复方肺积散对肿瘤组织VEGF表达的影响

组别NVEGF表达强阳性率

（始/终）阴性弱阳性强阳性（%）

肿瘤对照组15/13111184.61

化疗组15/1434750

中药组15/1323861.53

中药加化疗组15/1545640#

注：＃为与对照组比较P<0.01。

表格显示：对照组Lewis肺癌组织VEGF的强阳性率明显高于中药+DDP(P<0.01)，其他各组间两两比较差异无显著性(P>0.05)

3讨论

肿瘤在人体免疫功能作用下仍能发展、转移，表明肿瘤有其自己的保护机制。当机体发生肿瘤时，肿瘤细胞可以凭借多种方式逃避免疫系统的监控而分裂生长，这就是肿瘤的免疫逃逸。

肿瘤细胞能通过自分泌-旁分泌途径能分泌免疫抑制性细胞因子，如转化生长因子β(TGF-β)、白细胞介素-10(IL-10)、血管内皮生长因子(VEGF)和IL-4等，使肿瘤局部形成一个深度免疫抑制区，不仅使身在其中的免疫细胞功能受到严重抑制，甚至功能正常、活化的免疫细胞，一旦进入此环境也将成为免疫功能抑制的“沉默”细胞，是肿瘤免疫逃逸的重要机制之一，VEGF除通过与其受体的相互作用调控血管形成，为肿瘤细胞提供充足的血供外，还抑制DC分化的因子，可影响树突状细胞的分化与成熟，阻碍其抗原递呈功能，进一步影响CTL的扩增、活化及瘤细胞对CTL杀伤的敏感性，同时其还可通过上调Bcl-2的表达,抑制瘤细胞凋亡,在一定程度上限制了机体的有效抗肿瘤免疫。而Fas和FasL相互作用则是细胞凋亡的重要途径之一。FasL与靶细胞表面的Fas结合，启动后者的死亡信号，导致Fas阳性细胞凋亡，此为淋巴细胞杀伤肿瘤及病毒感染细胞的重要机制之一。

本研究表明复方肺积散可同时影响荷瘤小鼠Fas/FasL蛋白的表达和和抑制VEGF的表达，对免疫系统功能的正常表达有正向调节作用，可抑制肺癌细胞的免疫逃逸，为临床治疗肺癌提供了新思路。