拮抗金黄色葡萄球菌的海绵共附生微生物的筛选及鉴定

拮抗金黄色葡萄球菌的海绵共附生微生物的筛选及鉴定

曾臻谭强来(通讯作者)

（厦门医学院福建厦门361023）

【摘要】目的：筛选海绵共附生微生物并鉴定出对金黄色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株。方法：梯度稀释海绵匀浆液，涂布海水培养基，分离纯化典型特征菌落；采用纸片法筛选对金黄色葡萄球菌具有拮抗作用的菌株；采用16SrDNA法鉴定菌株。结果：共分离纯化得到7株典型菌株，其中1株对金黄色葡萄球菌具有较强的拮抗作用，经鉴定为短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）。结论：筛选并鉴定出一株强拮抗金黄色葡萄球菌的短小芽孢杆菌。

【关键词】海绵；金黄色葡萄球菌；拮抗；16SrDNA鉴定

【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）33-0204-02

海洋共附生微生物的次级代谢产物常具有天然类药性，是筛选新型药物的宝库[1]，是否具有抑菌活性是典型指标之一[2]。韦荣编等人分离了东海海绵共附生微生物并筛选活性次级代谢产物[3]。林敏等人从海水、海泥样中分离出29株具有抑菌活性的海洋细菌[4]。因此，本文拟通过传统培养技术分离、纯化海绵样品中共附生微生物，并对拮抗金黄色葡萄球菌的活性菌株进行筛选，为挖掘海洋微生物宝库提供基本素材。

1.材料与方法

1.1材料

海绵、金黄色葡萄球菌、E.coliDH5α由本实验室收集或保存，ExTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体购自大连宝生物，海水、LB培养基购自北京索莱宝，基因组DNA提取试剂盒购自北京天根。

1.2海绵共附生微生物的分离和纯化

海绵与无菌PBS混合匀浆，梯度稀释后涂布海水培养基，30℃培养72h，观察菌落生长状态，挑取典型单菌落分离和纯化。

1.3拮抗筛查实验

以金黄色葡萄球菌为敏感指示菌用纸片法筛查。分离纯化的菌株接种于海水培养基，30℃、180r/min振荡培养72h，过滤得发酵液备用；金黄色葡萄球菌37℃、180r/min振荡培养16h，按1%的量与温热LB固体培养基混匀；凝固后贴入无菌纸片，加入发酵液；37℃培养16h，观察抑菌效果。

1.416SrDNA菌株鉴定

挑选拮抗阳性菌株进行16SrDNA鉴定。提取细菌基因组DNA，以27f和1492r通用引物PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测合格，TA克隆，转化E.coliDH5α，挑选阳性克隆，上海生工测序。测序结果经NCBIBlast同源性比对鉴定。

2.结果

2.1菌株分离

经海水培养基筛选，根据菌落的典型形态特征分类，共分离纯化得到7株细菌。

2.2拮抗筛查

经纸片法筛查，其中编号为“2-10”的菌株对金黄色葡萄球菌有较强的拮抗作用（图1）。

2.3测序鉴定

16SrDNA测序，经同源性比对，与登录号“AB308441.1”匹配度为99%，经鉴定为Bacilluspumilus（短小芽孢杆菌）。

图1纸片法筛查7株细菌对金黄色葡萄球菌的拮抗作用

3.讨论

海洋共附生微生物由于协助宿主生长代谢或提供化学保护，常具有更丰富的代谢途径，从而产生更多活性产物。尹慢慢等人分离出14株具有较高抑菌活性的发形霞水母共附生细菌[5]。作者前期也曾从喷喘苔海绵中筛选分离出25株共附生微生物[6]。与其他生物相比，海洋微生物种类多、生长周期短、菌种易选育，更具有潜在产业化优势。因此，本文从海绵共附生微生物中筛选并鉴定出一株强拮抗金黄色葡萄球菌的短小芽孢杆菌，具有较高的研究和应用价值，为进一步开发海洋微生物药物奠定了基础。

【参考文献】

[1]周颖.共附生生海洋微生物抗菌活性物质的研究[J].农机化研究,2008,2(2):227-230.

[2]杨凯琳,程文胜,侯峰,等.海洋微生物次级代谢产物及其抑菌活性研究进展[J].中国海洋药物,2013,32(3):71-81.

[3]韦荣编,闫斌伦,李富超,等.海绵Hymeniacidoncorticata共附生微生物代谢产物生物活性的初步研究[J].中国海洋药物,2008,27(2):29-32.

[4]林敏,宁喜斌.具抑菌活性海洋微生物的筛选[J].微生物学杂志,2005,25(5):23-25.

[5]尹慢慢,徐凤,肖良,等.发形霞水母共附生生微生物的分离鉴定及其发酵液的抑菌活性研究[J].中国海洋药物,2014,33(1):31-39.

[6]ZengZ,ZhaoJ,KeC,etal.AntimicrobialactivitiesofnovelcultivablebacteriaisolatedfrommarinespongeTedaniaanhelans[J].ChineseJournalofOceanologyandLimnology,2013,31(3):581-590.