丙型肝炎实验诊断技术的研究进展

丙型肝炎实验诊断技术的研究进展

黄锦江1杨静2

黄锦江1杨静2（1成都市血液中心四川成都610000；2四川省人民医院四川成都610000）

【中图分类号】R516.2+3【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2011)6-0005-02

【摘要】建立具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法，尽早检出HCV感染者是阻断HCV传播的重要途径。本文对HCV各种病毒标志物的检测进行了综述。重点介绍了HCV免疫学、分子生物学的诊断技术及研究进展。

【关键词】丙型肝炎病毒实验诊断

丙型肝炎病毒(hepatitisCvirusHCV)是单股正链RNA病毒，属黄病毒科丙型肝炎属。HCV基因组含有一个开放读码框(ORF)，编码10余种结构和非结构(NS)蛋白，膜蛋白分布于病毒表面，NS3蛋白是一种多功能蛋白，氨基端具有蛋白酶活性，羧基端具有螺旋酶/三磷酸核苷酶活性；NS5B蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，均为HCV复制所必需，是抗病毒治疗的重要靶位[1]。丙型肝炎呈世界性分布。80年代末90年代初，在我国部分地区的职业献血者中曾出现丙型肝炎暴发流行。在河南、河北等部分地区有偿的献浆者或混合献血者中，HCV感染率高达20-30%。自1998年我国开始实施无偿献血后，随着无偿献血者比率的上升，抗-HCV阳性率逐渐下降。但由于HCV一般通过被污染的血液和血液制品传播，且有80-85%的感染者发展为慢性丙型肝炎，其中又有20%可发展为肝纤维化，最终有4-5%的肝纤维化患者发生肝细胞性肝癌，输血传播HCV危害仍然十分严重。国内至今还没有预防丙型肝炎的疫苗问世，也缺乏特效的治疗药物。建立针对HCV的具有高灵敏度、特异性和稳定性的检测方法，尽早检出HCV感染者是阻断HCV传播的重要途径。目前对HCV感染的实验室诊断包括HCV各种病毒标志物的检测，如：HCV特异性抗体（抗-HCV）、HCV特异性抗原（HCV-Ag）以及HCV-RNA核酸。

1.免疫学方法

1.1酶联免疫吸附试验(ELISA)

1.1.1抗体检测

上世纪九十年代初，利用重组HCV抗原开发出了抗HCV抗体检测技术，即酶免疫分析（EIA）技术，已经发展到第三代。第一代抗-HCVIgG试剂盒所用的抗原来自病毒基因组非结构区（C100），灵敏度低，抗体检出时间较晚，且C100抗体有可能出现间歇性阳性；非特异性反应较高。第二代试剂除上述C100抗原外又加入了HCV核心区多肽C22-3和非结构区抗原C33C，二者联合应用可进一步提高检出率。第三代试剂利用现代基因重组技术，对一些重要抗原采用更好的表达、纯化系统进行表达和纯化，对相应的基因片段进行了重新定位，利用各种先进的生产工艺、使包被抗原的活性更强，增加了检测的灵敏度；可检测样本中针对不同HCV抗原（如C区、NS3区、NS4区和NS5区等）的混合抗体，目前检测的特异性已高达99%以上。但由于厂家之间使用HCV基因重组抗原质量及各抗原片段包被比例的不同，各厂家试剂间的灵敏度和特异性存在着一定差异，从而导致抗-HCV检测结果不一致[2]。在HCV抗体ELISA法检测试剂盒中，由于酶标抗体是广谱抗人IgG抗体，对吸附在固相上的IgG抗体无筛选作用，降低了检测的特异性。一些慢性感染性疾病、自身免疫性疾病，由于患者体内IgG含量较高，容易产生假阳性结果。为了使血清样品中非特异性IgG含量尽量减少，降低非特异性吸附，一般需要稀释样品，这就降低了样品中特异性抗体的浓度，方法灵敏度下降。而且，在HCV感染后至抗HCV抗体产生之前还有一段约40-70天的较长时期。此时，献血员已被感染并具有感染性，应用目前的第三代EIA检测试剂不能检出，称为感染后血清阳转前的窗口期（preseroconversionwindowphase，PWP）。PWP的存在，是输血安全的重要威胁之一，使受血者依然有经输入抗HCV筛选阴性的血液而感染HCV的危险。

1.1.2抗原检测

丙肝病毒核心蛋白氨基酸序列十分保守，比较已有的HCV各分离株的氨基酸序列，其同源性超过95%，在病毒增殖及发病机制中起重要作用，是HCV感染的重要标志。HCV核心抗原作为HCV感染者体内出现的早期感染的标志，几乎与HCVRNA同时出现[3]。Ortho公司为了评价一种可检测血清中HCV核心抗原的ELISA检测试剂原型，通过24份血清阳转系列血清对抗HCV抗体、HCV-RNA和HCV抗原出现时间进行了比较。结果表明，HCV核心抗原的平均检出时间只比HCVRNA晚约1天[4]。HCV抗原检测耗时短，方法与常规酶免疫实验相似，不用添加仪器设备，大大缩短了窗口期[5]。但是，当机体出现抗-HCV抗体之后，体内HCV核心抗原和抗体相结合，抗原检出率降低或不能检出。因此，HCV核心抗原可应用于HCV感染早期诊断。对无偿献血者进行HCV-cAg和抗-HCV抗体联合检测，可进一步缩短窗口期，加强输血安全[6]。血清中HCV抗原的检测还有利于特殊HCV感染患者的早期发现，如某些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者和某些不产生抗体的携带者，结果表明HCV抗原的检出与HCV-RNA的动力学变化密切相关，可以作为HCV复制的标志[7]。

1.2其他免疫学方法

重组免疫印迹法(RIBA)是HCV感染的确证试验，主要解决ELISA试验中的假阳性问题。法国许多实验室常规采用EIA试验检测HCV抗体，阳性者再用RIBA试验证实。此策略所需费用较大。随着检测技术的提高出现的第三代EIA其敏感性与特异性均有很大提高，对于EIA阳性者，RIBA并不能提供更多的有关HCV感染的信息；对于EIA弱阳性者，RIBA可为阳性、不能确定或为阴性，无助于诊断,从费用-效益角度考虑，临床诊断HCV感染EIA检测即可，没有必要再用RIBA试验证实［8］。此技术也可应用于HCV血清型分型，但印迹这一操作较复杂，限制了这项技术在临床上的普遍使用。

斑点免疫渗滤试验(DIFA)和斑点免疫层析试验(DICA)用于抗HCV快速检测。DIFA是将抗原固定在滤纸上，向滤纸滴加样品液，待渗入后再滴加酶标抗体，最后滴加底物溶液，根据滤纸上是否出现斑点判断结果。在DIFA基础上发展了DICA，采用试纸条的形式，各种试剂均固定在试纸条上，检测时将样品滴加在试纸条的一端，将样品端放入一种溶液中进行“层析”，一段时间后根据试纸条上的显色情况判断结果。OraSure技术公司生产的OraQuickHCV抗体快速检测试剂盒已得到美国食品及药品管理局批准，用于丙型肝炎病毒检测。

化学发光技术和荧光酶免疫技术操作烦琐，一般仅用于科研。蛋白芯片目前正处于研究阶段。

2．核酸RNA的检测

HCV感染后一般到抗体转阳有一个较长的窗口期，约1-3%的患者抗-HCV可持续阴性，而基因组的复制出现得很早，感染后数天即出现病毒血症.已有输血后即有丙型肝炎病毒感染发生的报道，这表明抗-HCV阴性献血员中有少数存在丙型肝炎病毒输血传播的可能性[9]。目前检测血清中的HCV-RNA包括定性和定量两种方法。（1）HCV-RNA定性检测：对抗-HCV阳性的HCV持续感染者，需要通过HCV-RNA定性试验确证。HCV-RNA定性检测的特异度在98％以上，一次检测阴性并不能完全排除HCV感染，应重复检查。（2）HCV-RNA定量检测：定量聚合酶链反应(qPCR)、分枝DNA(bDNA)、实时荧光定量PCR法均可检测HCVRNA病毒载量。国外HCV-RNA定量检测试剂盒有PCR扩增的CobasV2.0、SuperQuant、LCxHCV-RNA定量分析法等，但bDNA的VersantHCVRNA2.0和3.0定量分析法应用较为广泛[1]。国内的实时荧光定量PCR法已获得国家食品药品监督管理局(SFDA)的正式批准。HCV病毒载量的高低与疾病的严重程度和疾病的进展并无绝对相关性，但可作为抗病毒疗效评估的观察指标。RT-PCR技术有许多优点，如：特异性强、敏感性高、阳性出现早、应用较广泛。但也存在不足：操作程序较复杂，技术要求严格，干扰因素多。HCV-RNA易被血细胞中的RNA酶降解，如果被检标本反复冻融、保存不当，将影响检测结果；HCV-RNA还受进食的影响，易与血中脂质及脂蛋白结合，降低检出率；另外，RT-PCR的多步骤实验中任何步骤的问题均易影响其检出，该方法也容易因污染而出现假阳性。目前各国的输血机构已经或正在实施微量混合HCV-NAT检测，以大容量Nuclisen自动化核酸抽提仪结合CobasAmplicor分析仪，用CobasV2.0试验使HCV-NAT检测的灵敏度达到最高。

3．HCV基因分型

HCV易发生持续感染并引起慢性严重肝病的原因可能就源于病毒基因组的高度变异性。Simmonds基因分型标准将HCV分为6个基因型。目前HCV基因分型有多种分子生物学方法，如：核苷酸测序法、型特异性引物扩增法、基因芯片法和型特异性探针杂交法、限制性片段长度多态性分析法(RFLPs)、遗传发育关系进化树分析法[10]。近年来,研究者们发现基因型特异性抗体可作为HCV基因分型的间接标志物，又提出血清学基因型的概念。血清学基因型在大规模地流行病学调查中显示出低污染率、危险性小、操作简单的优点,但又由于缺乏特异性及敏感性而应用受限。Chiron公司推出的RIBASIA,它包括分别从HCV基因组的NS4区截取的5种血清型特异性肽片段,2种从核心区截取的血清型特异性肽片段,可测1型到3型;MurexDiagnostics公司推出MurexHCV血清型酶免疫测定法，检测针对基因组NS4区编码的抗原决定簇的基因型特异性抗体,可检测1型到6型。

丙型肝炎病毒抗体、抗原和RNA的联合检测已成为HCV感染诊断的主要指标，缩短了窗口期，有利于丙肝患者早期诊断和治疗，有利于采供血机构加强输血安全。

参考文献

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[10]张瑞,杜绍财.丙型肝炎病毒基因分型的研究进展.中华检验医学杂志,2006,29(5):1-2.