不同砷化合物对人胚肾细胞系HEK-293毒性的研究

不同砷化合物对人胚肾细胞系HEK-293毒性的研究

张娜

张娜（太航医院山西太原030006）

【摘要】目的观察不同砷化合物对体外培养的的人胚肾细胞系HEK-293细胞毒性。方法培养的HEK-293分别暴露于三氧化二砷（As2O3,iAsⅢ，0～50μmol/L）、砷酸氢二纳（Na2HAsO4•7H2O，iAsⅤ，25～500μmol/L）、二甲基砷酸钠（C2H6ASO2Na﹒3H2O，DMA，25～500μmol/L）24h，应用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞生存率。结果不同剂量范围内的iAsⅢ、iAsⅤ除了50，100，300μmol/LC2H6ASO2Na﹒3H2O均能够显著降低HEK-293的细胞生存率(P<0.05);对细胞的毒性从从大到小依次为:iAsⅢ>iAsⅤ>DMA。结论通过氧化应激损伤，三种形态砷化物在一定剂量范围内对人胚肾细胞系HEK-293细胞有毒性作用。

【关键词】三氧化二砷砷酸氢二钠砷中毒人胚肾细胞系

【中图分类号】R914【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）22-0120-02

随着社会发展，砷在工农业、医药及化学领域被广泛应用，这在不同程度上造成环境污染，直接或间接影响到人体的健康。但由于目前通过动物实验无法模拟其致癌性，其慢性中毒机制及癌变机制尚不清楚。砷进入机体后迅速入血并随血液分布到全身各个器官,肾脏为其排泄、蓄积和毒性作用的主要靶器官[1,2]。目前，有关砷暴露对肾脏和肾细胞影响的实验研究尚不多见，本研究观察不同砷化合物对体外培养的人胚肾细胞系HEK-293的细胞生存率影响，为进一步了解不同形态砷对肾脏损伤的作用方式提供研究基础。

1实验材料

1.1主要试剂

三氧化二砷（衡阳市福鑫化工厂），砷酸氢二钠（上海新宝精细化工厂），二甲基砷酸钠（上海沪峰化工有限公司），甲基偶氮唑盐(MTT,美国Sigma公司)。

1.2仪器

CO2培养箱(日本三洋公司),低温离心机(日本Sigma公司),倒置显微镜（连庆88078），酶标仪(Model1680，日本)。

2实验方法

2.1细胞培养

HEK-293细胞常规方法培养。以含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM高糖完全培养液培养HEK-293细胞株,置于37℃,5％CO2培养,待细胞进入对数生长期，用0.15%胰蛋白酶消化传代。

2.2细胞处理

待细胞生长良好，取对数生长期细胞胰酶消化后，1*105/ml密度接种于96孔板上（留有8个孔未加细胞，做空白对照），1*105/ml密度接种于24孔板上，培养24小时后，分别加入含砷化物培养液，各种砷化物浓度分别为，As2O3:0，0.25，1.0，25.0，50.0μmol/L；Na2HAsO4•7H2O：0，25.0，50.0，100.0，200.0，300.0，400.0，500.0μmol/L；二甲基砷酸：0，25.0，50.0，100.0，200.0，300.0，400.0，500.0μmol/L。0.25～300μmol/L每小组设立7个平行孔，400.0和500.0μmol/L每小组设立5个平行孔，设立8孔只加培养液，不加细胞和任何药物作为阴性对照。每孔最终体积为200μL。将培养板置于37℃，5％CO2培养箱分别培养24h。

2.3四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞增殖率

接种96孔板细胞与As2O3，Na2HAsO4•7H2O，二甲基砷酸共培养24h的HEK-293细胞每孔加入5g/LMTT液20μL，继续培养4h后吸除培养液，各加入二甲基亚砜200μL，震荡10min。在酶标仪上测定各组在波长570nm和490nm的吸光度值，根据公式：细胞相对生长抑制率=1-(实验组A值/对照组A值)×100%，计算各组HEK-293细胞的生长抑制率[3]。

2.4统计分析

所有的统计数据以均数±标准差（x-±s）表示，统计分析用Sigmaplot12.0统计软件，采用t检验进行分析，P＜0.05有统计学意义。

3实验结果

不同砷化物对HEK-293细胞增殖的影响

表1可见As2O30.25-50.0μmol/L组与阴性对照组相比，吸光度值均显著降低（0.25μmol/L组：P≤0.05；其他：P≤0.01），1.0μmol/L组最低，As2O31.0-25μmol/L浓度区间存在线性关系，即随浓度增加抑制率逐渐降低。结果表明0.25-50.0μmol/LAs2O3对人胚肾细胞（HEK-293）的生长均有抑制作用，本实验中1.0μmol/LAs2O3对HEK-293细胞毒性最大。

表2可见Na2HAsO4•7H2O25-500.0μmol/L组与阴性对照组相比，吸光度值均显著降低（P≤0.01），各组之间不存在线性关系。结果表明25-500.0μmol/LNa2HAsO4•7H2O对人胚肾细胞（HEK-293）的生长均有抑制作用，本实验中25.0μmol/LNa2HAsO4•7H2O对HEK-293细胞毒性最大。

表3可见C2H6ASO2Na﹒3H2O25-500.0μmol/L组与阴性对照组相比，C2H6ASO2Na﹒3H2O25.0-200.0μmol/L组吸光度均值均高于对照组，且25.0、200μmol/L组均显著高于对照组（P≤0.05），300-500.0μmol/L组吸光度均值均低于对照组，且400、500μmol/L组均显著低于对照组（P≤0.05），各组之间存在线性关系，即随浓度增加吸光度值逐渐降低。结果表明25.0-200.0μmol/LC2H6ASO2Na﹒3H2O低浓度促进细胞增殖，随着浓度增加300-500.0μmol/LC2H6ASO2Na﹒3H2O抑制HEK-293细胞增殖。

表1不同浓度As2O3对HEK-293细胞生长增殖的影响（x-±s，n=7）

As2O3浓度(μmol/L)吸光度A抑制率（%）

0.250.555±0.200▲29.60±20.02

1.00.384±0.144▲▲51.38±14.42

12.50.446±0.044▲▲43.54±4.37

25.00.514±0.082▲▲34.84±8.20

50.00.473±0.071▲▲40.03±7.15

空白0.089±0.055—

阴性对照0.789±0.172—

附:与空白对照组比较：▲▲表示P≤0.01，▲表示P≤0.05

表2不同浓度Na2HAsO4•7H2O对HEK-293细胞生长增殖的影响

（x-±s，n=7）

Na2HAsO4•7H2O浓度(μmol/L)吸光度A抑制率（%）

25.00.338±0.100▲▲57.18±10.02

50.00.427±0.106▲▲45.95±10.62

100.00.417±0.061▲▲47.12±6.12

200.00.520±0.101▲▲34.15±10.15

300.00.536±0.119▲▲32.05±11.89

400.00.321±0.064▲▲59.31±6.37

500.00.367±0.205▲▲53.46±20.47

空白0.089±0.055—

阴性对照0.789±0.172—

附:与空白对照组比较：▲▲表示P≤0.01，▲表示P≤0.05

表3不同浓度二甲基砷酸对HEK-293细胞生长增殖的影响

（x-±s，n=8）

C2H6ASO2Na﹒3H2O浓度(μmol/L)吸光度A抑制率

（%）

25.01.140±0.031▲-15.80±3.65

50.01.249±0.076-26.88±8.91

100.01.031±0.176-4.75±2.07

200.00.997±0.021▲-1.27±2.41

300.00.691±0.0886.76±10.28

400.00.586±0.065▲29.75±7.67

500.00.255±0.044▲40.42±5.16

空白0.132±0.055—

阴性对照0.984±0.035—

附:与阴性对照组比较：▲▲表示P≤0.01，▲表示P≤0.05

4讨论

砷进入机体后迅速入血并随血液分布到全身各个器官,肾脏为其排泄、蓄积和毒性作用的主要靶器官。无机砷及其代谢物的排泄是一个复杂的过程,包括肾小球过滤、分泌和近端小管的重吸收等。而砷毒性又取决于其化学形式,一般认为亚砷酸盐(As3+)毒性大于砷酸盐(As5+)，亚砷酸盐和砷酸盐在许多种属包括人类体内均要代谢为单甲基胂(MMA)和二甲基胂(DMA)，而MMA和DMA的急性毒性是亚砷酸盐的1/100～1/50[3]。本研究在微量砷化物孵育24h的条件下,探讨了不同形态砷化物对人胚HEK-293细胞损伤的作用，砷化物的抑制细胞生长的能力依次为As2O3>Na2HAsO4•7H2O>C2H6ASO2Na﹒3H2O。亚砷酸盐(As3+)对HEK-293细胞的毒性大于砷酸盐(As5+)与文献报道类似[4]，C2H6ASO2Na﹒3H2O的表现与以往报道有所不同。

砷可使超氧阴离子自由基含量增加[5]。细胞抗氧化酶SOD能清除细胞ROS，避免细胞过度氧化应激。在孙贵范等[6]的动物实验研究中，中剂量组肾脏超氧化物歧化酶(SOD)活性显著增加，高剂量组则显著下降。本实验下一步将用12.5-50.0μmol/LAs2O3、25.0、300-500μmol/LNa2HAsO4·7H2O刺激HEK-293检测其SOD水平，来进一步阐述超氧阴离子自由基与SOD的关系。

参考文献

[1]洪峰.008无机砷的肾脏损伤作用研究进展[J].国外医学卫生学分册,2002,29(1):

[2]李冰,陆春伟,孙贵范.不同砷化合物对血管内皮细胞毒性的研究[J].卫生研究,2006,35(6):700-2.

[3]应方微,唐松,刘桂琴.三氧化二砷对体外培养A375黑色素瘤细胞的生长抑制作用及机制初步研究[J][J].中国实用眼科杂志,2010,28(5):548-51.

[4]AposhianHV,AposhianMM.Arsenictoxicology:fivequestions[J].Chemicalresearchintoxicology,2006,19(1):1-15.

[5]LantzR,ParlimanG,ChenGJ,etal.Effectofarsenicexposureonalveolarmacrophagefunction:I.EffectofsolubleAs(III)andAs(V)[J].Environmentalresearch,1994,67(2):183-95.

[6]李富君,孙贵范.砷与脂质过氧化的研究进展[J].中国地方病学杂志,1999,18(3):228-30.