可溶性程序性死亡受体-1及其配体在胸腔积液诊断的意义

可溶性程序性死亡受体-1及其配体在胸腔积液诊断的意义

孙川李黎

孙川李黎通讯作者

（湖北省中山医院肿瘤科；湖北武汉430000）

【摘要】目的：探讨可溶性程序性死亡受体-1（sPD-1）及其配体（sPD-L1）在不同性质胸腔积液中的诊断意义。方法：收集我院自2018年1月～2018年12月首次入院治疗的不明原因胸腔积液患者84例的胸腔积液和胸膜活检组织，采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定胸腔积液上清液中sPD-1和sPD-L1水平；用实时荧光定量PCR法（Rt-PCR）检测胸膜组织sPD-1和sPD-L1的表达。结果：不同性质的胸腔积液和胸膜组织的sPD-1和sPD-L1水平不同，其中炎性胸腔积液sPD-1和sPD-L1水平较低，而结核性胸腔积液和恶性胸腔积液较高，与炎性胸腔积液相比都有差异（P＜0.05）；恶性胸腔积液sPD-1和sPD-L1水平和结核性胸腔积液相比有差异（P＜0.05）；炎性胸膜组织sPD-1mRNA和sPD-L1mRNA的表达结果与结核性胸膜组织和恶性胸膜组织表达结果相比有差异（P<0.05）。结论：sPD-1和sPD-L1有助于区分不同性质的胸腔积液，尤其是在结核性还是恶性胸腔积液诊断上有较好的临床意义。

【关键词】胸腔积液，可溶性程序性死亡受体-1，可溶性程序性死亡受体配体-1

胸腔积液是感染性疾病和非感染性疾病中常见的并发症，临床上常见为渗出液，但不能判断具体病因易引起误诊，尤其是结核性与恶性的鉴别上难以区分[1]。本文检测不同性质胸腔积液患者的胸腔积液sPD-1和sPD-L1水平以及其胸膜组织的表达，探讨其在不同性质胸腔积液的诊断价值。

材料和方法

1研究对象收集我院自2018年1月～2018年12月首次入院不明原因胸腔积液患者84例，男性48例，女性30例，其中炎性胸腔积液28例，平均年龄54岁，结核性胸腔积液31例，平均年龄36岁，恶性胸腔积液25例，平均年龄63岁。炎性胸腔积液符合以下标准：①患者血培养或胸腔积液细菌培养阳性；②胸腔积液葡萄糖<3.3mmol/L,pH值<7.2。结核性胸腔积液符合以下标准：①胸腔积液找到抗酸杆菌，②胸腔积液呈渗出液，结核菌素试验阳性。恶性胸腔积液符合以下标准：①影像学符合原发性支气管肺癌合并胸腔积液改变，②肺组织活检病理学确诊肺癌，③胸腔积液找到癌细胞或胸膜活检样本病理学确诊为转移性腺癌。剔除标准，符合以下任一1项：①胸腔积液确诊不明；②入院前三天接受过任何治疗；③合并免疫系统疾病。本研究经过本院伦理委员会批准，所有患者都签署知情同意书。

2方法入院后第一时间取胸腔积液50ml，用肝素抗凝后离心取上清液2ml，所有样本于-70℃备用。采用ELISA检测样本sPD-1和sPD-L1水平，所有样本检测由同一人一次完成。试剂盒来自上海华大科技有限公司,按照试剂盒操作说明进行。胸膜组织取自胸腔穿刺部位6点钟，将取好标本于-80℃备用。用Trizol试剂（购自美国Invitrogen公司，批号：15996-026）提取总RNA，逆转录按照说明书操作。引物设计：Primer5.0Rotor-gene6.0,CorbettReserach生产。Ppia,上游：5′GCCGAACCGTTACGAACGAAG3′，下游：5′CCGGAACGGAATCGTACGACC3′长度156bp；sPD-1上游：5′GGCATCGGAAAGGTACGACGG3′长度158bp，下游：5′CGGTTGGGTTACGTACGAGGCA3′长度162bp；sPD-L1上游：5′ACATTGGATAGATACGAGGC3′长度113bp,下游：5′CCATAGCATTGATAGGAGAT3′长度115bp。目的基因和管家基因PCR反应体系：dNTP(2.0mmol/l)2.0μl，10×PCR缓冲液2.5μl，MgCl2溶液1.5μl，Taq聚合酶（1units，SybergreenI）2.5μl，10uMPCR特异引物F和R各1μl，cDNA1μl，加水至总体积25μl；PCR反应条件：94℃5分钟；42个循环（93℃25秒；60℃25秒；70℃31秒）；73oC6分钟。将PCR产物10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8，1×10-9。几个梯度稀释DNA模板和所有cDNA样品分别配置Rt-PCR反应体系。置Rt-PCR仪上（CorbettResearch生产）反应;Ppia（ENF）：93℃6min；42个循环（93℃12秒；58℃20秒；70℃25秒；80℃5秒）。Ppia（BSR）：95℃8min；40个循环（95℃15秒；59℃15秒；73℃20秒；80.5℃5秒）。sPD-1：95℃5min；40个循环（95℃10秒；59℃15秒；72℃20秒；83℃5秒）。sPD-L1：95℃10min；43个循环（95℃15秒；59℃10秒；72℃25秒；75℃5秒）。结束后从72℃缓慢加热到98℃建立PCR产物熔解曲线，各样品目的基因和管家基因浓度由机器生成。每个样品目的基因浓度除以其管家基因浓度，即为此样品此基因校正后的相对含量。

3统计方法采用SPSS17.0统计软件，计量资料用均数±标准差,组间比较采用多组间方差分析（F检验），如果差异有统计学意义（P＜0.05），两组采用LSD-t检验。

结果

1不同原因胸腔积液患者中sPD-1和sPD-L1水平的比较

炎性胸腔积液的sPD-1和sPD-L1水平分别是（10.21±３.12）ng/ml、（1.18±0.43）ng/ml,结核性分别是（17.34±1.11）ng/ml、（3.78±0.32）ng/ml,恶性分别是（29.41±2.09）ng/ml、（6.54±0.51）ng/ml。结核性和恶性胸腔积液较高，与炎性相比都有差异（P＜0.05）；恶性胸腔积液sPD-1和sPD-L1水平和结核性相比有差异（P＜0.05）。见表1。

2不同原因胸腔积液患者胸膜组织中sPD-1mRNA和sPD-L1mRNA表达

结核性和恶性胸腔积液的胸膜活检组织sPD-1mRNA和sPD-L1mRNA表达水平都高于炎性胸膜组织的表达，有差异（P＜0.05），且恶性胸腔积液患者的胸膜组织sPD-1mRNA高于结核性，两者相比有差异（P＜0.05）。见表2。

表2不同原因胸腔积液胸膜组织中sPD-1mRNA和sPD-L1mRNA表达比较(×102)。

讨论

PD-1属于CD28家族，PD-1广泛表达于肿瘤浸润性淋巴细胞、Ｂ细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞表面。PD-Ll是PD-1主要的配体，与肿瘤细胞表面的配体PD-Ll结合之后，导致肿瘤微环境中PD-L1/PD-1信号通路持续激,PD-1可抑制T细胞的增殖和活性，使其对肿瘤细胞攻击、杀伤功能丧失,此外肿瘤细胞表面PD-L1的过表达本身亦可增强肿瘤细胞抗杀伤的能力［2］，并刺激肿瘤干细胞增殖［3］促进肿瘤生长。引起恶性胸腔积液主要是通过淋巴途径转移，其次是原发性恶性胸膜肿瘤，而引起恶性胸腔积液常见的恶性肿瘤为肺癌，肺癌中以非小细胞肺癌常见，sPD-L1在非小细胞肺癌高度表达[4]。本实验表明在恶性胸腔积液患者其胸腔积液sPD-1和sPD-L1水平较高，胸膜组织中也提示高度表达。这说明sPD-1和sPD-L1是诊断恶性胸腔积液潜在的指标。肖鹏等[5]研究也表明sPD-L1的表达与I期肺腺癌患者胸膜受累、临床分期、病理类型等存在相关性。

结核感染中，机体感染结核杆菌后由Th1细胞介导产生细胞免疫和体液免疫，在这免疫反应过程中有大量的T淋巴细胞和单核巨噬细胞被激活，激活的细胞表面上表达出PD-1，PD-1与PD-Ll相结合，激活信号通路，降低机体免疫能力、减弱T细胞免疫应答能力，使结核杆菌逃避机体免疫杀伤并使机体呈持续性感染状态。在本文研究中结核性胸腔积液患者的胸腔积液中sPD-1和sPD-Ll水平较高，与炎性胸腔积液患者相比，有比较意义，这一结果和潘雪等[6]在结核性胸膜炎患者胸腔积液发现sPD-Ll表达显著增高类似。

本文表明不同性质的胸腔积液sPD-1和sPD-Ll水平不同，胸膜组织的表达也不同，结核性和恶性胸腔积液sPD-1、sPD-Ll水平与炎性胸腔积液相比有差异，且恶性胸腔积液sPD-1和sPD-Ll水平也高于结核性胸腔积液，两者相比也有差异；胸膜组织表达结果也相同。这表明胸膜组织分泌大量的sPD-1和sPD-Ll，其主要原因可能是转移的恶性肿瘤细胞在其肿瘤微环境中大量刺激T淋巴细胞，表达出sPD-l，并与sPD-Ll结合，逃避机体免疫系统使肿瘤细胞继续生长繁殖。总之，sPD-1和sPD-Ll可能在不同性质胸腔积液的诊断中起着重要的作用，尤其是在区别结核性还是恶性胸腔积液上有重要的参考价值。

参考文献

1曹探赜，杜荣辉，连展，等.胸腔积液中白介素-20与-22的水平及其临床意义[J].中华结核和呼吸杂志，2016,39.（8）:608-611.DOI:10.3769/cma.j.issn.1001-0939.2016.08.012.

2AzumaT,YaoS,ZhuG,etal.B7-H1isaubiquitousantiapoptoticreceptoroncancercells[J].Blood,2008,111(7):3635-3643.DOI:10.1182/blood-2007-11-12314．

3YangY,WuKe,ZhaoE,etal.B7-H1enhancesproliferationabilityofgastriccancerstem-likecellsasareceptor[J]．Oncollett,2015,9(4):1833-1838.DOI:10.3892/OL,2015.2949.

4VelchetiV,SchalperKA,CarvajalDe,etal.Programmeddeathligand-1expressioninnon-smallcelllungcancer[J]．LabInvest,2014,94(1):107-116.DOI:10.1038/lanbinvest.2013.130.

5肖鹏，张晓，靳超.程序性死亡配体-1表达对I期肺腺癌术后患者预后的价值[J].中国现代医学杂志,2018,28(27):45-52.DOI:10.3969/j.issn.1005-8982.2018.27.009.

6潘雪，邢玉斐，施敏骅，等．可溶性程序性死亡配体1在结核性胸膜炎患者胸腔积液和外周血中的表达及意义[J]．中华医学杂志,2014，94（20）:1543-1546．