乌头碱对XG-7细胞免疫抑制作用的实验研究

乌头碱对XG-7细胞免疫抑制作用的实验研究

常志芳1冯成龙1史晓霞2王永福

常志芳1冯成龙1史晓霞2王永福1

（1内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院014010）

（2内蒙古科技大学包头医学院医学技术系014010）

【摘要】目的：通过体外实验的方法研究乌头碱对XG-7刺激后细胞增殖及细胞上清中分泌的IgG水平的变化情况，探讨其可能的免疫抑制的作用。方法：分别采用1ug/ml、10ug/ml、1000ug/ml工作浓度的乌头碱溶液刺激体外培养的多发骨髓瘤细胞系XG-7作用24、48、72h,采用CCK-8活细胞计数法检测细胞增殖及毒性情况，同时应用ELISA法检测细胞72h后培养上清IgG水平。结果：1.三种不同浓度的乌头碱溶液对XG-7细胞增殖均有抑制作用，且呈现浓度依赖性。2.不同时间的药物对细胞的增殖均有抑制作用，呈现时间依赖性。3.三种不同浓度的乌头碱刺激细胞后IgG水平均有下降的趋势，但与对照组相比较并没有统计学差异。结论：乌头碱可以抑制B细胞增殖，因此推测乌头碱可能有明显的免疫抑制作用，但是目前对其具体如何发挥免疫抑制的作用机制了解尚少，还需要进一步深入探索。

【关键词】乌头碱B细胞免疫抑制

【中图分类号】R446.5【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2014）12-0041-02

自身免疫性疾病是由于长期感染，物理、化学因素刺激等诱因，机体自身耐受机制被破坏，自身应答T细胞或B淋巴细胞被活化，因而对自身成分发生免疫应答而导致的疾病。B淋巴细胞具有的多种免疫功能使之成为炎症过程中不可或缺的重要组成部分。XG-7是浆细胞性恶性肿瘤,浆细胞是终末分化期B淋巴细胞，分泌单克隆抗体。乌头碱是存在于乌头属植物中，具有解热镇痛作用。

本研究通过体外实验的方法研究乌头碱对XG-7刺激后细胞增殖及细胞上清中分泌的IgG水平的变化情况，探讨其可能的免疫抑制的作用，对临床中自身免疫疾病的治疗提供线索。

一.材料与方法

1.实验药物与试剂

1.1乌头碱购自中国药品生物制品检定所，纯度>98%,批号：52268，精密称取乌头碱，用0.1mol/l盐酸溶解，加生理盐水稀释，用1mol/lNaOH调PH至6.0，加生理盐水至足量，于冰箱内保存最多3天，由包头医学院药理教研室赠送。RPMI1640购自美国GBICOGO公司，细胞培养上清IgGELISA试剂盒购自上海生工，CCK-8试剂盒购自同仁化学研究所。

1.2细胞株

多发性骨髓瘤细胞系XG-7由北京大学人民医院风湿免疫实验室赠送，用含10%胎牛血清RPMI1640培养基常规培养，以工作浓度为3ng/ml的rhIL-6刺激生长。

1.3CCK-8检测乌头碱对XG-7细胞增殖的抑制作用。

将对数生长期的XG-7细胞以5×105个/ml接种于96孔培养板中,分别将乌头碱溶液药物配成3个级别成倍比稀释浓度梯度(用1640培养液稀释),每一浓度的药物设3个平行孔，另设无药物细胞对照组置于培养箱中分别培养24h、48h、72h后,每孔加入10ulCCK-8,继续培养2小时，酶标仪检测450nm处的吸光度值,计算细胞活力。实验重复三次，按以下公式计算细胞活力：细胞活力（%）=[（A加药-A空白）/(A0加药-A空白)]×100%A加药:实验孔的吸光度（含有细胞的培养基、CCK-8、药物）A空白：空白孔的吸光度（不含细胞和药物的培养基、CCK-8）A0加药：对照孔吸光度（含有细胞的培养基、CCK-8、无药物）

1.4CCK-8检测乌头碱对XG-7细胞毒性作用

将对数生长期的XG-7细胞以5×105个/ml接种于96孔培养板中,置于培养箱培养24h后，在培养板中加入乌头碱溶液，将乌头碱溶液药物配成3个级别成倍比稀释浓度梯度(用1640培养液稀释),每一浓度的药物设3个平行孔，另设无药物细胞对照组置于培养箱培养24h、48h、72h后,每孔加入10ulCCK-8,继续培养2小时，酶标仪检测450nm处的吸光度值,计算细胞活力。

1.5ELISA法检测细胞培养IgG含量：取制备好的细胞悬液（6×106个/ml）接种于6孔培养板中，同时分别加入浓度为1ug/ml、10ug/ml、1000ug/ml乌头碱溶液，每一浓度的药物设3个平行孔，培养72小时后，收集各组细胞培养液，1000r/min离心5分钟收集细胞上清，用人细胞上清IgGELISA试剂盒检测细胞培养上清中IgG含量，操作步骤严格按照说明书进行。

二．结果

1.乌头碱对XG-7细胞增殖作用呈现浓度依赖性及时间依赖性

为探讨乌头碱对XG-7细胞的增殖作用，分别将不同浓度的乌头碱作用24、48、72h后，应用CCK-8法检测细胞的活性，结果发现不同浓度、不同时间的乌头碱溶液对细胞增殖均有抑制作用，呈现浓度依赖浓度性和时间依赖性，结果见图1。

图1不同浓度的乌头碱刺激细胞后对细胞活力的影响

2.乌头碱对XG-7细胞毒性的影响

为探讨乌头碱对XG-7细胞毒性的影响，分别将不同浓度的乌头碱作用24、48、72h后，应用CCK-8法检测细胞的毒性，结果发现不同浓度、不同时间的乌头碱溶液对细胞增殖均有毒性作用，但与空白对照组相比较并没有统计学差异。

图2不同浓度乌头碱对细胞毒性的影响

3.乌头碱对XG-7细胞上清IgG水平的作用

为探讨不同浓度乌头碱溶液对XG-7细胞IgG分泌的影响，我们用ELISA法检测细胞上清中IgG的含量，结果发现经乌头碱刺激后细胞培养上清的IgG含量呈现下降趋势，但与对照组相比差异没有统计学差异。

图3不同浓度的乌头碱对细胞上清IgG水平影响

三．讨论

该项目旨在研究蒙药乌头碱治疗自身免疫性疾病的机制，通过细胞培养，测定乌头碱对XG-7细胞的增殖抑制作用以及其毒性作用，并测定经乌头碱作用后，细胞分泌IgG水平，从而推测乌头碱的作用机制，本课题组已完成了上述全部实验，得出如下结果1.三种不同浓度的乌头碱溶液对XG-7细胞增殖均有抑制作用，且呈现浓度依赖性。2.不同时间的药物对细胞的增殖均有抑制作用，呈现时间依赖性。3.三种不同浓度的乌头碱刺激细胞后IgG水平均有下降的趋势，但与对照组相比较并没有统计学差异。由此得出结论：乌头碱可以抑制B细胞增殖，因此推测乌头碱可能有明显的免疫抑制作用，但是目前对其具体如何发挥免疫抑制的作用机制了解尚少，还需要进一步深入探索。

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