正交实验优选黄芪甲苷的提取工艺研究

正交实验优选黄芪甲苷的提取工艺研究

来丽丽李剑杨洁红张宇燕周惠芬

来丽丽李剑杨洁红张宇燕（通讯作者）周惠芬

（浙江中医药大学浙江杭州310053）

【摘要】目的正交实验法优化提取黄芪中黄芪甲苷。方法采用紫外分光光度法建立黄芪甲苷的含量测定方法；采用L9（34）正交表，考察醇浓度，提取时间，次数对黄芪甲苷提取率的影响。结果正交实验结果表明用8倍量80％乙醇提取2次，每次2h为最佳工艺。结论本试验优化了黄芪甲苷的提取工艺，可为含黄芪药材的制剂工艺优化提取提供参考。

【关键词】黄芪甲苷正交实验优化提取工艺

【中图分类号】R284【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）23-0079-02

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，具补气固表，利尿托毒，排浓，敛疮生肌的作用，在临床具有广泛的应用。黄芪中含有黄芪甲苷、黄芪多糖和多种氨基酸等成分。黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一，属三萜皂苷类，常作为指标性成分用于黄芪药材的质量监控。现代药理研究表明，黄芪甲苷具有改善白细胞变形能力、改善心肌收缩及舒张功能、促进胰岛素分泌和清除自由基等药理作用。本试验以黄芪甲苷为指标，用紫外分光光度法建立黄芪甲苷含量测定方法，并以黄芪甲苷的得率为评价指标，用正交试验进行黄芪醇提工艺的研究，优化黄芪提取工艺。

1仪器与试剂

TU-1900双光束紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；黄芪药材：购自北京同仁堂（毫州）饮片有限责任公司，批号：20110307；黄芪甲苷对照品（110781-200613）：中国药品生物制品检定所。

2方法与结果

2.1对照品溶液的制备：精密称定黄芪甲苷对照品2.8mg，加60％甲醇溶解，并定容至10ml，作为浓度为0.28mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备：取黄芪药材10g，加75％乙醇30ml，回流2次，每次1.5h，滤液定容至20ml，加2％KOH20ml回流1h，滤液挥去乙醇，调至中性，调整至100ml，用乙酸乙酯提取2次（120、100ml），取水液用水饱和正丁醇萃取3次（150、120ml），正丁醇液用水洗涤2次，正丁醇液回收并挥干，残渣加甲醇使溶解，并定容至5ml，作为供试品溶液。

2.3检测波长的选择：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液1ml、供试品溶液0.5ml，分别置25ml具塞磨口试管中，水浴挥干溶剂，分别加入5％香草醛冰醋酸液0.20ml，高氯酸0.80ml，密塞，于70℃水浴恒温加热20min，取出后用流水冷却，加冰醋酸5ml，摇匀。以相应的试剂为空白，于300～800nm波长处扫描，结果在585nm处有最大吸收。

2.4黄芪甲苷标准曲线的制备：精密吸取黄芪甲苷对照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40ml，置25ml具塞磨口试管中，水浴挥干溶剂，加5％香草醛冰醋酸液0.2ml，高氯酸0.8ml，70℃水浴恒温20min，取出用流水冷却，加冰醋酸5ml，摇匀。以相应的试剂为空白，在585nm处测定其吸光度Abs。以黄芪甲苷对照品液浓度（ug/ml）为横坐标，相应的吸收度（Abs）为纵坐标，进行线性回归分析，得到黄芪甲苷的标准曲线为y＝0.044x+0.0162（r＝0.9996，线性范围7.000～18.667ug/ml）。

2.5精密度试验：按标准曲线项下方法测定黄芪甲苷对照品溶液（11.667ug/ml）的吸光度（Abs），并计算其相对标准偏差RSD为0.40％。

2.6稳定性试验：取供试品溶液30ul，于显色后0、0.5、1、2、3、4、6h测定其吸收度，计算其RSD为0.83％，表明供试液在6h内基本稳定。

2.7重复性试验：去5份同一批药材，按照标准曲线方法制备、测定供试品溶液的吸光度，依标准曲线计算黄芪甲苷的含量，结果计算其RSD为1.15％。

2.8加样回收率实验：精密吸取已知含量的药材，加入黄芪甲苷对照品，按供试品制备方法配制供试品溶液，按标准曲线项下方法测定吸光度（Abs），计算其平均回收率为97.06％，RSD为1.21％。

2.9正交提取工艺研究：采用L9(34)正交表,以黄芪甲苷的含量为评价指标，考察乙醇浓度、溶媒用量、提取时间和提取次数对提取效果的影响。因素与水平安排见表1。分别称取黄芪10g，按表1方法提取制备正交供试液，根据标准曲线测定各供试液中黄芪甲苷的含量，分析确定黄芪的最佳工艺条件。正交实验结果及方差分析见表2、表3。

表1影响黄芪甲苷提取效果的四因素三水平表

查方差分析表，F(0.05)(2,9)=4.26，F(0.01)(2,9)=8.02

结果分析：以黄芪甲苷的含量进行评价，则：

影响因素程度依次为D>A>C>B

A因素：极显著性因素，且Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ

B因素：无显著性影响，Ⅰ>Ⅱ>Ⅲ

C因素：显著性因素，且Ⅲ>Ⅰ>Ⅱ

D因素：极显著性因素，且Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ

由上可见，最佳提取条件应为A3B1C3D2。

2.10最佳工艺的验证：称取黄芪10g三份，按最佳工艺条件（即8倍80％乙醇提取2次，每次2h）提取，按供试品溶液测定方法测定黄芪甲苷含量，进行最佳工艺的验证。结果见表4。结果表明，按最佳工艺提取，黄芪甲苷的提取比正交实验中高，表明最佳工艺可行。

表4最佳工艺的验证

3分析与讨论

黄芪甲苷（astragalosideⅣ）为四环三萜皂苷类成分，紫外吸收较差，易受溶剂干扰，仪器检测比较困难。黄芪中所含有的黄芪苷（astragaloside）类成分的β-D-xylose上的乙酰基，在碱性条件下处理时，很容易水解掉，而变成astragalosideⅣ，因此本试验将醇提液，用碱液回流后，用乙酸乙酯、水饱和正丁醇液、水分别萃取、洗涤进行纯化，减少测定时对黄芪甲苷的干扰。黄芪甲苷含量测定的方法很多，有薄层色谱法[1]、比色法[2]、高效液相色谱法[3]等，本实验采用紫外分光光度法建立黄芪甲苷的含量测定方法，采用L9(34)正交表进行黄芪提取工艺的优化研究，并进行工艺验证，结果表明黄芪甲苷的最佳提取工艺条件为8倍80％乙醇提取2次，每次2h，黄芪甲苷的提取率较高，可为含有黄芪及黄芪甲苷的制剂工艺研究提供参考。

参考文献

[1].张玲，胡庆文，郭承军等.5种含黄芪中成药中黄芪甲苷的含量测定[J].时珍国医国药，2003，14（1）：7.

[2].余灏，杨胜华.黄芪皂甙分析方法研究近况[J].华西药学杂志，1993，8(3):163.

[3].徐玖环，徐秀丽，米振清.高效液相色谱法测定黄芪精中黄芪甲苷含量[J].中国药事，2002，11(16)∶701.