青春期龈炎下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因的调查分析

青春期龈炎下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因的调查分析

佟伟利1马镜萍2

佟伟利1马镜萍2

（1通化市口腔医院吉林通化134000；2梅河口友谊医院的吉林梅河口135000）

【中图分类号】R78【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)17-0063-02

【关键词】龈炎牙周斑基因型牙龈卟啉单胞菌

牙龈蛋白酶是一种由牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）产生和分泌的蛋白酶，它与持续的Pg感染、牙龈炎症、肿胀、出血倾向、龈沟液的产生及牙周组织破坏等病理过程密切相关，其中牙龈蛋白酶K(gingipainsk,Kgp)是最有潜能的纤维蛋白降解酶。曾有报道青春期龈炎下菌斑中的Pg具有相对的Kgp基因型，为评估青春期龈炎的P.gingivalis特异Kgp基因型的发生率，揭示其与牙周疾病严重程度间有无相关关系，从而为牙周疾病的预防提供信息，现做了以下调查分析。

1资料与方法

1.1调查对象及分组病例选自中通化卫生学校的新生，年龄14～18岁。青春期龈炎的诊断依据：青春期个体，唇侧龈缘及牙周乳头肿胀，探诊易出血，牙龈指数（gingivalindex,GI）≥1，但附着水平无改变。试验分两组，青春期龈炎组36例，牙龈健康组（GI＝0）36人，每组男女比例为1：1。入选标准：①全身系统性疾病；②近期3个月内未服用免疫制剂和抗生素；③无正畸及牙周治疗史④无吸烟史。所有调查究对象均之情同意。

1.2牙周临床检查在采集菌斑之前，检查并记录每例被检查者上、下颌的第一磨牙与切牙（指数牙，同时也为菌斑采样牙）的GI、龈沟出血指数（sulcusbleedingindex,SBI）及探诊深度(probedepth,PD)，分别取其平均值。

1.3Pg分离培养和DNA提取对每例被检查者上下颌的第一恒磨牙与切牙，用无菌刮匙自信去除龈上菌斑后，棉卷隔湿，吹干，用龈下刮匙插入龈沟底采集龈下菌斑，将采集的菌斑混合，放入200μl厌氧装运夜中，室温下涡旋振荡器震荡30s分散菌斑。将分散的细菌溶液10倍梯度稀释。取100μl稀释液接种于5mg/L氯化血红素，10mg/L维生素K1和5%无菌脱纤维羊血的BHI培养基（Gibco,美国)，厌氧培养5～7d。根据菌落的形态特征和革兰氏染色结果，挑取可疑Pg分离培养3d。增菌后-70℃保存备检。酚-氯仿抽提法提取细菌DNA。

1.416SrRNAPCR法鉴定龈下菌斑中的Pg。

1.5PCR法扩增编码KGP催化域的基因片段;引物序列及反应条件Beikler等设计，扩增片段长度为792bp，由上海生物工程有限公司合成。利用Abiprism310序列自动分析仪进行PCR产物测序，结果进行局部序列相似性检索（basiclocalalignmentsearchtool，BLAST）。

1.6Kgp基因的检测（酶切电泳）酶切体系20μl，包括PCR产物15μl，限制性内切酶MseI（NewEngland公司，英国）0.5μl，10倍NEB缓冲液2μl，灭菌ddH2O2.3μl,37℃24h.于2.0%琼脂糖凝胶（含0.5mg/L溴化乙锭）上100V电泳40min，300nm紫外灯下观察并照相。以100bpDNAladder为相对分子质量标准（大连宝生物公司）。根据PCR产物酶切后的长度变化读出基因。

1.7统计学分析结果用SPSS11.5软件包进行分析。用秩相关检验分析Kgp的酶活性及表达强度与各牙周指数之间的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1Kgp基因片段PCR产物的序列分析及酶切结果基因序列同源性为90%～97%，与P.gingivalisW83的基因组序列进行BLAST，确认为Kgp基因片段。PCR产物酶切电泳后分别出两种基因型，kgp-A型由于序列中有2个MseI切点，点以后3个条带，长度分别为102、288、402bp，kgp-B型因为无MseI切点，只有1条带，长度792bp.DNA测序基因分型结果与酶电泳结果相同。

2.2Kgp基因型的检测率P.gingivalis有毒株W83表现为Kgp-A型，而无毒株ATCC33277表现为KGP-B型。青春期龈炎组36例之中有20例P.gingivalis阳性，牙龈健康组36人之中有9例P.gingivalis阳性。所有P.gingivalis阳性个体的龈下菌斑中均检测出Kgp基因型，kgp-A型在青春期龈炎组和青春期龈炎健康组P.gingivalis阳性个体中检出率分别为80.0%和22.2%，Kgp-B型在青春期龈炎组和青春期牙龈健康组的P.gingivalis阳性个体中检出率分别为20.0％和77.8%。均具有显著正相关关系，差异有统计学意义（P＜0.5）。

2.3Kgp基因型与各牙周临床指数间的相关分析经序和检验，青春期龈炎组P.gingivalis定值的个体中，各牙周临床指数与kgp基因型分布无相关性，差异无统计学意义（P＞0.5）。

3讨论

调查发现青春期口腔中适宜的环境，使P.gingivalis的定值更为稳定。P.gingivalis在儿童和成年人检出率相似，为一过性定值，牙周健康者中也可检测到P.gingivalis。

本次分析结果表明，在青春期龈炎组P.gingivalis阳性个体中，Kgp-B型比Kgp-B型更常见，而在青春期牙龈健康组中，P.gingivalis型更常见。P.gingivalis有毒株W83表现Kgp-A型，而无毒株ATCC33277表现为Kgp-B型。特异性的P.gingivalis基因型在患病个体中检出率远高于健康个体。推测青春期龈炎的特异Kgp基因型与疾病严重程度之间有相关性，Kgp-A型可能会更好的适应环境的改变，不同的Kgp基因型可能与P.gingivalis菌株的毒力有关，青春期龈炎个体多数定值P.gingivalis的有毒株，Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。