实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的检测及临床意义

实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸的检测及临床意义

徐贺

（黑龙江省中医药科学院检验科黑龙江哈尔滨150036）

【摘要】目的:探讨乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒(HBV)的实时荧光PCR定量方法及临床意义。方法：对60例临床血清标本用荧光PCR定量检测的操作方法及临床意义。结果：乙型肝炎大三阳患者血清HBVDNA检出率为100%,HBVDNA的对数值为7.2±1.8;小三阳患者血清HBVDNA检出率为64.5%,HBVDNA的对数值为4.9±1.3。结论：HBVDNA是HBV感染后病毒血症最直接的标志，是判断病毒复制最灵敏的指标，同时也是判断慢性乙型肝炎是否具有活动性的重要指标。

【关键词】实时荧光PCR定量检测；乙型肝炎；病毒脱氧核糖核酸；临床意义

【中图分类号】R51【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2017）28-0171-02

实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)通常分为二步：首先从标本中提取HBVDNA，然后采用实时荧光PCR扩增HBVDNA。目前荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测技术逐渐应用于临床实验诊断[1]。本实验采用实时荧光定量PCR方法(PCRFQ-PCR)测试了60份临床血清标本结果进行分析。

1.材料与方法

1.1标本来源

收集本院住院及门诊收治的乙肝患者血清60份，健康体检者血清60分，其中男40例，女20例，年龄7～80岁。

1.2标本采集、保存与运送

无菌采集静脉血3ml，收集于无菌离心管中(不抗凝或采用EDTA、枸橼酸钠抗凝)，室温放置不超过2h，1600g离心20min，分离血清或血浆，转入无菌离心管中备用。分离的血浆或血清在4℃保存不应超过24h；-20℃保存不超过3个月；-70℃以下长期保存。应避免反复冻融。采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。

1.3方法

主反应混合物的配制，从试剂盒中取出HBVPCR反应液、Taq/UNG酶、HBV荧光探针和MgCl2，室温融化并振荡混匀后，2000r/min离心10s。设所需要的EP管管数为M(M=标本数+1管阴性对照+1管临界阳性对照+1管阳性对照+4管阳性工作标准品)，则按下表配制主反应混合物，充分混合均匀，2000r/min离心10s，向设定的EP管各分装26μl，转移至标本处理区[2]。HBVDNA的提取(加热裂解法)，血清标本、试剂盒内阳性对照、临界阳性对照和阴性对照各取100μl(冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10s)，分别加入100μl核酸提取液A，振荡混匀10s，13000r/min离心lOmin，弃上清，然后分别加入25μl核酸提取液B至沉淀中，振荡混匀10s，100℃金属浴10min，13000r/min离心2min，备用。PCR反应体系的配制，向装有主反应混合物的EP管中分别加入提取的DNA溶液(冻存的DNA溶液在使用前应室温充分融化，振荡混匀数s，13000r/min离心2min)、阳性工作标准品各4μl，混匀，分别取20μl混合液置于不同的毛细管中，盖紧管盖，转移至PCR扩增与检测区。PCR扩增与检测将毛细管连同Roche专用金属反应管套放入离心机中，于2000r/min离心10s。然后将毛细管排好放入“Lightcycler”荧光PCR仪内，记录标本的顺序。

2.结果

健康体检者阳性数60例100%，LogDNA平均值（7.45±2.45），定量测值范围（1.4×105～7.0×109）ml-1。乙肝患者中HBsAg(+)、HBeAb(+)、HBcAb(+)者26例，阳性数11例，LogDNA平均值（6.34±1.85），定量测值范围（0～8.0×107）ml-1。HBsAg(+)、HBcAb(+),者7例，阳性数4例，LogDNA平均值（5.95±0.95），定量测值范围（0～7.0×107）ml-1。HBeAb(+)、HBcAb(+)者2例，阳性数1例，LogDNA平均值（5.34±4.55），定量测值范围（0～4.0×103）ml-1。HBsAb(+)者11例，阳性数1例，LogDNA平均值4.7，定量测值范围（0～5.0×104）ml-1。五项全阴14例，HBV-DNA结果与ELISA检测结果均为0。

3.讨论

实时荧光PCR是一种将先进的光学技术、温控技术、荧光素标记技术以及计算机软件有机结合的新型PCR，能够对PCR的每一个循环的荧光强度进行监测，故称为实时荧光PCR。实时荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)通常分为二步：首先从标本中提取HBVDNA，然后采用实时荧光PCR扩增HBVDNA。本试验涉及的实时荧光PCR是以Taqman技术为基础的荧光PCR，与经典的PCR技术比较，Taqman技术在反应体系中增加一种荧光素标记的寡核苷酸探针，探针的5′端标记荧光素的报告基团，3′端标记淬灭基团，当探针完整时，发生荧光共振能量转移，发光基团发出的荧光被淬灭基团所吸收，因此无荧光产生[3]。当进行PCR扩增时，Taq酶具有5′-3′核酸外切酶的活性，能够将探针水解成游离的核苷酸，此时荧光共振能量转移消失，报告基团发出的荧光不能被吸收而产生荧光。每循环一次Lightcycler等实时荧光PCR仪记录一次荧光强度，然后根据荧光强度曲线判断标本或标准达到阈值时所经历的循环数(CT)，每个标本的CT值与起始HBVDNA拷贝数的对数存在线性关系，即CT=A-Blg[C]，起始拷贝数越高，CT值越小，因此Lightcycler等荧光PCR仪根据标准曲线与标本的CT值即可判断是否存在目的核酸以及目的核酸的量。

HBVDNA是HBV感染后病毒血症最直接的标志(金标准)，是判断病毒复制最灵敏的指标，同时也是判断慢性乙型肝炎是否具有活动性的重要指标。HBVDNA是判断乙肝患者传染性高低的重要指标之一，HBVDNA通常与传染性呈正相关。而且当乙肝3系的检测结果不是经典类型，或HBV的核心或前核心启动子发生突变时，HBVDNA在判断传染性高低中的作用更为突出[4]。当HBVDNA的浓度小于5000copies/ml时，或HBV突变不能产生正常的病毒蛋白抗原时，HBVDNA的检测价值优于HBV相应抗原的检测。观察抗病毒药物治疗的疗效：治疗有效的患者，HBVDNA的水平显著下降，通常HBVDNA的水平下降到105copies/ml以下，表示治疗有效，有效治疗的患者，HBVDNA的水平甚至可下降到场200copies/ml以下。此方法是监测HBV耐药的间接方法。乙肝患者在治疗过程，HBVDNA不下降或下降不明显，应考虑HBV发生变异，产生耐药，应进一步采用基因分型的方法进行检测。HBVDNA的检测能缩短HBV感染的窗口期，与HBsAB比较，能缩短窗口期6～15天，如用于献血员的检测，能提高输血的安全性。

【参考文献】

[1]李成德,岑丽莲,陈金强,等.磁珠分离纯化技术在实时荧光定量PCR检测HBVDNA中的应用[J].现代检验医学杂志,2011,26(3):68-71.

[2]杨志钊,梁锦胜,蔡常辉.荧光PCR定量检测乙型肝炎病毒的临床意义[J].华夏医学,2001,14(4):423-424.

[3]肖艳群,陈慧英,张锦锋,等.实时荧光定量PCR与PCR-ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量检测中的应用比较[J].检验医学,2005,20(4):319-321.

[4]宏芳,付晓野,董玉琳,等.荧光探针定量PCR检测HBV-DNA[J].上海医学检验学杂志,2000,15(1):18-19.