蜂胶总黄酮对大鼠急性放射性肠损伤的保护作用及对P38MAPK途径的影响

蜂胶总黄酮对大鼠急性放射性肠损伤的保护作用及对P38MAPK途径的影响

余磊1唐巧云1楚建军2

余磊1唐巧云1楚建军2

(1江苏大学附属人民医院肿瘤科210029)

(2无锡市第四人民医院肿瘤科214062）

【摘要】目的：研究蜂胶总黄酮对大鼠肠道放射损伤的保护作用以及对P38丝裂原活化蛋白激酶途径的影响。方法：50只大鼠随机分为5组：正常对照组，模型组，总黄酮高低剂量组（200ml/kg/d，100/kg/d），N-乙酰半胱氨酸组，除正常对照组外其余各组给药后第4天予6MVX线单次腹部照射9Gy，照射后3d处死大鼠取材，原位末端标记法检测肠黏膜凋亡，酶联免疫吸附法（ELISA）测定TNF-α含量，蛋白印迹法检测P38MAPK的表达情况。结果：模型建立成功：模型组TUNEL法肠黏膜凋亡明显增多，P38MAPK活化和TNF-α表达亦明显增加(P<0.05)；与单纯照射组相比，蜂胶总黄酮组肠黏膜凋亡减少及P38MAPK活化受到抑制，TNF-α表达减少，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：蜂胶总黄酮对大鼠急性放射性肠损伤有一定保护作用，其机制可能与一定程度抑制P38MAPK激活，减少TNF-α表达有关。

【关键词】蜂胶总黄酮放射性肠损伤急性细胞凋亡P38丝裂原活化蛋白激酶肿瘤坏死因子-α

【中图分类号】R453【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）24-0092-02

盆腹腔肿瘤放疗的患者常易并发急性放射性肠损伤，一旦发生不仅极大限制了放疗正常进行，且严重影响患者生存率和生活质量，给患者带来极大痛苦。目前机制不完全清楚，尚无有效治疗措施。蜂胶具有抗炎，抗辐射，抗氧化，清除自由基的作用，其主要有效成分是总黄酮，有报道黄酮对缺血再灌注肠损伤有保护作用[1]，但在放射性肠损伤方面的研究报道较少。本文拟建立大鼠放射性肠损伤模型，通过总黄酮干预研究其保护作用以及相关机制，以期为临床防治放射性肠损伤提供新的策略和思路。

1.材料与方法

1.1试验动物及材料：健康清洁级成年雄性SD大鼠50只，体重220-260g，（江苏省无锡市血吸虫病防治研究所提供，动物合格证号：苏BKS2007-003），TNF-α试剂盒（南京凯基生物科技有限公司产品），兔抗鼠总P38MAPK及磷酸化P38MAPK多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司产品），N-乙酰半胱氨酸（美国sigma公司产品），-80℃冰箱（日本三洋MDF-382E），紫外分光光度计（美国Beckman公司），医用电子直线加速器(美国Varian2300CD23EX)。

1.2实验动物分组：将健康清洁级成年SD大鼠50只，在清洁动物房内用标准饲料适应性喂养3天，温度18～22℃，湿度50%，普通光照6：00—18：00，自由饮水，观察大鼠无不良反应，进食饮水活动正常。随机分为五组：C组正常对照组（n=10）：未作腹部照射；R组单纯照射组（n=10）：仅接受单次腹部照射。T1组总黄酮高剂量组（n=10），灌服总黄酮200mg/kg/d连续7天+单次腹部照射。T2组总黄酮低剂量组（n=10），灌服总黄酮100mg/kg/d连续7天+单次腹部照射。N组NAC组设为阳性对照（n=10），灌服N-乙酰半胱氨酸200mg/kg/d连续7天+单次腹部照射。

1.3模型的建立及取材：给药后第4天，将实验大鼠（除对照组外）禁食12h，不禁水，逐一称重后用10%水合氯醛按3.5ml/kg腹腔注射麻醉，固定在特制有机玻璃板上，医用直线加速器予6MVX线单次腹部照射9GY，剂量率4.5GY/min，照射时间2min，照射范围为剑突至耻骨联合，照射面积8.5cm*5.5cm，源皮距（SSD）=100cm。照射完毕将大鼠放回笼内待其苏醒，自由活动及饮水。所有大鼠照射后第3天禁食12h处死动物取材。

1.4检测指标：

1.4.1原位末端标记法（TUNEL）观察细胞凋亡：取回肠组织中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡脱水，严格按照说明书操作，封片，置于荧光显微镜下观察凋亡细胞（绿色荧光颗粒为阳性细胞，即凋亡细胞），在高倍镜下（×400）每张切片随机选取5个视野计算凋亡指数（apoptosisindex，AI），AI=凋亡细胞/总细胞数×100%，5个视野下的平均值代表每张切片的实际AI。

1.4.2酶联免疫吸附法（ELISA）测定TNF-α含量：大鼠麻醉后用EDTA抗凝管心脏取血2ml，2000rpm离心10分钟后取上层血浆，分装后置于-80℃冰箱保存，严格按照TNF-α试剂盒操作说明书测定。

1.4.3蛋白印迹法（westernblotting）测定P38MAPK磷酸化表达：按照试剂盒说明书分别提取小肠组织匀浆液中的细胞浆蛋白和细胞核蛋白。采用BCA法绘制标准曲线测定样本蛋白浓度，按照westernblotting方法说明逐步操作，将免疫印迹所得条带经图像扫描分析，以平均灰度值为P38MAPK含量的相对值。

2.统计学分析

实验数据用x-±S表示，SPSS16.0统计软件包进行数据处理，组间比较采用方差分析检验。检验水准a=0.05，P≤0.05差异有统计学意义。

3.结果

3.1TUNEL凋亡结果：R组细胞凋亡较C组明显增多，主要发生在肠黏膜上皮细胞，固有层细胞及黏膜下层细胞，两者差异有统计学意义（P<0.05）；与R组相比，总黄酮及NAC组凋亡细胞明显减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

3.2血浆TNF-α结果：R组TNF-α含量较C组明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；总黄酮及NAC组TNF-α较R组下降较显著，差异有统计学意义（P<0.05），其中T1，T2组降低呈一定的剂量依赖性。

3.3蛋白印迹检测P38MAPK磷酸化的表达结果：C组基本无P38MAPK的磷酸化表达；与C组相比，R组磷酸化P38MAPK表达明显增多，差异有统计学意义（P<0.05），表明P38MAPK活化途径参与放射性肠损伤；与R组相比，T1，T2及N组磷酸化P38MAPK明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），表明总黄酮可一定程度抑制P38MAPK激活。

4.讨论

盆腹腔肿瘤接受放射治疗的患者，80%发生小肠黏膜辐射损伤，尤其是回肠[2]，主要表现为上皮黏膜细胞广泛坏死凋亡,严重的血管反应和出血[3]。目前发病机制尚不完全清楚，缺乏行之有效的防治措施，严重影响患者的治疗及预后，因此积极防治本病的发生发展具有重要的临床意义。

P38丝裂原活化蛋白激酶（P38mitogen-activitedproteinkinasa）是一种相对分子质量为38000的苏氨酸酪氨酸蛋白激酶，生理状态下主要定位于细胞浆中，各种理化因素如紫外线，放射线，缺血再灌注，氧化应激等刺激后活化转位于细胞核，发生P38蛋白磷酸化，促进相关炎性因子和凋亡蛋白的表达，参与细胞炎症，凋亡以及免疫应答等病理过程[4-5]。有研究[6-7]发现肠道损伤如炎症，缺血，凋亡等病理机制与丝裂原活化蛋白激酶（MAPKS）有关。ZhengSY等[8]证实抑制P38MAPK通路活化可明显减轻胃肠缺血再灌注造成的损伤及细胞凋亡。张健[9]等发现P38MAPK通路参与小肠移植排斥细胞凋亡转导途径并起重要作用。

杨明等[10]研究证实蜂胶总黄酮对心肌缺血再灌注损伤具有明显保护作用，认为与抗心肌细胞凋亡有关。周永海[11]等研究表明黄酮类物质可以降低间歇低氧大鼠脑区P38MAPK激活，从而减轻间歇缺氧后脑损伤。本实验拟建立放射性肠损伤模型，通过蜂胶总黄酮干预研究其保护作用及对P38MAPK途径的影响。近来研究[12-13]表明N-乙酰半胱氨酸（NAC）能够抑制P38MAPK途径激活，减少炎症介质和凋亡因子的释放，从而阻止细胞凋亡。因此本实验选取NAC为阳性对照。本实验通过高能X线全腹部照射9Gy建立肠损伤模型，TUNEL法检测肠黏膜细胞凋亡明显较正常组增多，证实放射肠损伤模型建立成功。

综上所述，蜂胶总黄酮可一定程度减轻大鼠受照射后肠道损伤，抑制肠黏膜细胞凋亡，本实验推测可能与抑制P38MAPK活化，减少TNF-α表达有关，从而为临床防治放射性肠损伤提供一种新的思路以及实验支持，但其最佳给药剂量及具体机制仍有待进一步研究。

参考文献

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