多胺对大鼠肝星状细胞Bcl-2蛋白表达的影响

多胺对大鼠肝星状细胞Bcl-2蛋白表达的影响

张静1李学文2曹志伟3李欣欣4

张静1李学文2曹志伟3李欣欣4

1.牡丹江医学院解剖教研室；2.2014级临床专业9班；3.2015级临床专业12班；4.李欣欣，2014级麻醉专业6班

【摘要】目的：研究多胺对大鼠肝星状细胞增殖和Bcl-2蛋白表达的影响，初步探讨多胺诱导肝星状细胞凋亡相关机制。方法：大鼠肝星状细胞HSC-T6在37℃、5%CO2孵箱中常规培养。阳性对照组加入多胺（5umol/L）的cDMEM作用于HSC-T6细胞24h后，利用倒置相差显微镜观察HSC-T6细胞数量及形态学变化。Westernblotting检测HSC-T6细胞中Bcl-2、Bax蛋白的相对表达水平。结果：1.多胺作用于HSC-T6细胞24h后，与对照组相比，细胞密度和体积均增大，多角伪足增加。2.Westernblot检测用药组细胞内Bcl-2蛋白表达与对照组相比明显上调，而Bax蛋白表达明显下降，Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。结论：1.多胺对HSC-T6细胞增殖具有促进作用。2.多胺抑制HSC-T6细胞凋亡，其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达有关。

【关键词】多胺；肝星状细胞，Bcl-2蛋白

肝纤维化是由各种致病因子所导致肝内结蹄组织异常增生，弥漫性细胞外基质过度沉淀的一个病理过程。活化的肝星状细胞（Hepaticstellatecell，HSC）增殖是肝纤维化发生的重要因素。用药物干预肝星状细胞的增殖，对于预防肝硬化的发生具有重要意义[1-2]。

1材料与方法

1.1材料

细胞HSC-T6细胞株具有永生化表型购买于中科院上海细胞库；多胺（美国Sigma公司）；Bcl-2、Bax（1：200，武汉博士德公司）。

1.2方法

1.2.1细胞培养

HSC-T6HSC-T6使用含有10%FBS的DMEM培养于37℃、5%CO2湿度的孵箱内，细胞处于对数生长期时进行传代，长到第三代后，按实验所需浓度接种于6孔培养板中，分为对照组和实验用药组，设6个复孔。培养12h弃去培养液，加入含多胺（5umol/L）样品液cDMEM继续培养24h后，与倒置相差显微镜下观察细胞形态变化；同时取部分样品按照Westernblot操作流程观察Bcl-2和Bax蛋白的表达。

1.2.2Westernblot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax蛋白的表达按照蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白。BCA法蛋白定量法（参照说明书进行）测各组蛋白浓度。用细胞裂解液将各组蛋白稀释至等浓度，与5χ上样缓冲液按4：1混合，100℃变性5min。孵一抗（Bcl-2、Bax抗体均为1：200），以内参β-actin为对照，实验重复3次。

1.2.3统计学方法

采用SPSS13.0分析数据，数据用平均数±S表示，组间比较采用单因素方差分析，P<0.01为差异有统计学意义。

2结果

2.1多胺对HSC细胞形态的影响

倒置相差显微镜观察结果显示，与对照组细胞相比，多胺作用HSC-T6细胞24h后，可见对照组细胞密度较大，细胞贴壁生长，形态呈长梭形，有多角伪足。

2.2多胺对HSC细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

与对照组相比，多胺作用组细胞内Bcl-2蛋白表达明显上调，而Bax蛋白表达明显下降，Bcl-2/Bax比值明显升高（P<0.01）。

3讨论

肝纤维化作为肝脏对损伤的一种修复反应，其中心环节是肝脏炎症反应激活HSC，活化的HSC增殖加快，分泌大量胶原在细胞外基质过多沉淀。活化的HSC的嗲我是肝纤维化发生逆转的重要原因。用某种药物干预肝纤维化的发展过程，对于降低肝纤维化的进展，控制预防肝硬化、肝癌具有重要的意义。

迄今为止，临床上尚缺乏特异性针对肝纤维化的有效逆转或阻止其进展的药物。而且没有特别明确的深入研究肝纤维化的相关机制以及识别关节靶点分子。但是有学者指出，HSC是抗肝纤维化治疗的主要指标，若抑制HSC的活化增殖，促进其凋亡和衰老等过程中涉及的关节分子和信号通路均可提供治疗靶点。有学者实验证实了天然多胺对肝细胞ODC基因的表达起着反馈调节作用，而且实验也证明了多胺对肝的再生起着关键作用，但是目前尚没有学者研究过多胺对HSC是发挥再生作用还是诱导其凋亡作用[2]。

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡相关基因研究中研究最多的一类蛋白质。Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最有代表性的抑制凋亡基因和促进凋亡基因，并且Bax是Bcl-2活性的主要调控因子[3]。

本研究发现多胺作用于HSC，可增加细胞密度、增大细胞体积。同时明显上调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达，抑制凋亡促进蛋白Bax的表达，导致Bcl-2/Bax比值明显升高，细胞向增殖方向转化。可见，多胺可显著促进HSC增殖并抑制凋亡，从而促进肝脏纤维化的发生。其机制可能与多胺上调Bcl-2的表达，抑制Bax的表达有关。当然，HSC的增殖及凋亡机制非常复杂，涉及许多细胞因子及调节蛋白和各种信号通路，还需进一步研究HSC增殖和凋亡的有关机制。

参考文献：

[1]张国民，王鑫，赵新辉．肝纤维化形成机制的研究进展［Ｊ］．中国健康月刊，２０１1，３０（８）：５６－５８．

[2]夏海珊，陈少茹，钟月春，等．肝纤维化的发病机制和药物治疗现况［Ｊ］．中国医药导报，２０１４，１１（１８）：１６２－１６５．

[３]梁红梅，朱清静，杨玲，等．剔毒护肝方药物血清对肝星状细胞凋亡相关蛋白Ｂｃｌ-2、Ｂａｘ的影响［Ｊ］．中西医结合肝病杂志，２００９，１９（２）：９８－９９．

注：基金项目：牡丹江市科学技术计划项目（Z2017s0047）；黑龙江省省大学生创新创业训练计划项目（201710229051）