副溶血性弧菌两种增菌方法的比较

副溶血性弧菌两种增菌方法的比较

陈孟权陈新元林刚金勇琴杜季梅

陈孟权陈新元林刚金勇琴杜季梅(温州医学院检验医学院浙江温州325035)

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）27-0085-02

【摘要】目的比较普通增菌法和摇床培养增菌法对副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus,Vp）的增菌效果。方法采用测量吸光度值和菌落计数检测Vp数量，直接分离法和PCR法测定方法灵敏度。结果普通培养增菌法可使菌量在3h增加200倍，摇床培养法可增加2000倍。1.3×102cfu/ml的Vp在普通增菌3h后可直接分离培养，3.8×101cfu/ml培养3h后可用PCR法检出；5×101cfu/ml的Vp在摇床增菌3h后可直接分离培养，2.5×100cfu/ml增菌3h后可用PCR法检出。结论摇床培养在短时间内快速增菌效果比普通增菌法好。

【关键词】副溶血性弧菌摇床培养增菌

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus,Vp）是一种嗜盐性细菌，主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼类、虾类、贝类、牡蛎等海产品中，具有致病性的菌株能引起人类食物中毒，是我国沿海地区夏秋季节最常见的一种食物中毒[1]。人可因食用被本菌污染而未煮熟的海产品而引起中毒，在细菌性食物中毒中占了很大的比例［2］。近年来世界发病率呈上升的趋势［3］,我省舟山、象山地区每年都有副溶血性弧菌引起食物中毒的报道［4，5］。因此，副溶血性弧菌的快速检测对于食品卫生监督和出入境检验检疫均具有非常重要的意义。副溶血性弧菌传统的分离鉴定方法主要是生化表型鉴定法，不仅耗时长，操作复杂，而且灵敏度有限，易受环境差异影响[6]。对于含该菌较少的海产品，通过传统鉴定方法很难在短时间内检出。因此，对样品进行快速有效增菌，可提高副溶血性弧菌检出率。

本实验对普通培养法和摇床培养法增菌效果进行比较，结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验菌株副溶血性弧菌ATCC17802

1.2主要试剂与仪器振荡培养箱，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；722型紫外分光光度计，上海欣茂仪器有限公司；碱性蛋白胨水、TCBS、M-H培养基，购自杭州天和微生物试剂有限公司；DNA提取试剂盒（GK1071）购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.3细菌培养

1.3.1细菌准备将副溶血性弧菌ATCC17802接种到TCBS上，35℃培养18h后，连续传代2次，挑取单个菌落接种于3%NaCl的碱性蛋白胨水，35℃培养12h。

1.3.2细菌接种调节菌悬液至104cfu/ml，在6个装有100ml3%Nacl蛋白胨水的培养瓶中各加入1ml菌悬液，其中3个放35℃恒温箱静置做普通增菌培养，另3个放35℃摇床，150r/min振荡培养。

1.3.3菌量测定每隔30min取培养菌液，以3%NaCl的碱性蛋白胨水调零，用722型紫外分光光度计，1cm比色皿于波长600nm处，测定菌液吸光度值，同时用M-H做菌落计数。

1.3.4分离培养菌悬液做10倍倍比稀释，分别取不同浓度20ul菌液及两种方法的不同时段菌液接种TCBS，35℃培养24h观察结果。

1.4PCR检测[7]不同初始浓度菌液摇床培养3h后取1ml用DNA提取试剂盒提取DNA，用PCR法检测。副溶血性弧菌引物由上海桑尼公司合成，引物序列为F:5’-AAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，R:5’-GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC-3’，扩增片段长度450bp。PCR体系（25μl）：10×PCRBuffer2.5μl，dNTPMixture2μl，上下游引物各0.5μl，Taq酶0.1μl，18.4μlddH2O，1μlDNA模板；94℃预变性4min；94℃变性30s、58℃退火45s、72℃1min，共35个循环；72℃后延伸10min。扩增产物用1.0%琼脂糖100V恒压电泳，凝胶成像分析系统观察结果。

1.5统计方法t检验。

2结果

2.1两种方法对初始菌量为102cfu/ml的3%氯化钠蛋白胨水进行增菌,90min内增菌后吸光度值无统计学差异(p＞0.05),2h开始摇床培养与静置培养的菌液OD值出现显著差异（P＜0.05）。普通培养法和摇床增菌培养法的时间-吸光度曲线见图1。

2.2两种方法对初始菌量为102cfu/ml的3%氯化钠蛋白胨水增菌，普通培养法和摇床培养法细菌菌落计数结果显示，60min内两者的菌量差异无统计学意义(p＞0.05)，90min及之后摇床培养法增菌后的菌量显著高于普通培养法（P＜0.05）。摇床培养法增菌3h可将菌量提高至起始浓度的2000倍以上，增菌效果比普通培养法高10倍左右。普通培养法和摇床增菌培养法的菌量对数-吸光度曲线见图2。

2.3分离培养结果

浓度大于104cfu/ml的副溶血性弧菌悬液可在TCBS上直接分离培养出阳性结果。

2.4PCR检测结果

浓度大于2.5×102cfu/ml的副溶血性弧菌悬液能扩增出450bp特异性条带。初始浓度为3.8×101cfu/ml的菌液经静置培养3h后PCR检测阳性；初始浓度为2.5×100cfu/ml的菌液经摇床培养3h后PCR检测阳性；PCR结果见图3。

3讨论

副溶血性弧菌是广泛分布于沿海地区的海洋性细菌，为海产食品引起急性胃肠炎的重要病原菌之一，尤其是在夏秋季节，经常因食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品或被此菌污染的食品，引起爆发性食物中毒[8]。近年来因食用被其污染而未煮熟的海产品引起食物中毒的病例越来越多，食品卫生要求越来越严格，副溶血性弧菌也引起了越来越多研究者的重视。传统的检测方法主要靠分离培养和直接免疫荧光等方法，由于方法学本身的原因，需耗时3～7天[9]。

传统细菌培养法可分离的最低浓度为1.9×104cfu/ml[9]，目前较多学者主要采用的PCR法灵敏度较高，检测下限可达1.9×102cfu/ml[10]，与本实验结果相符。高学祥等报道实时荧光定量PCR法可检测出浓度为10cfu/ml的菌液[11]，该法对实验设备及技术成本要求较高。本研究利用摇床培养技术对副溶血性弧菌进行快速增菌3h后，采用常规PCR检测，使检测下限达到了2.5cfu/ml，具有快速、灵敏的特点。本法虽然较常规PCR法增加了增菌的步骤，但包括核酸提取在内整个检测时间仅为6～8h，可在一个工作日内出结果，比传统细菌培养法所需时间大大缩短，适合用于食品卫生和食物中毒的快速检测。

参考文献

［1］张朝武，等.卫生微生物学[M].北京：人民卫生出版社,2009：136.

［2］李庆山.副溶血性弧菌所致食物中毒的研究进展[J].中国卫生检验杂志，2009，19（2）：461-463.

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［5］宋晓荷，林朝，朱小桢.象山地产海产品副溶血性弧菌污染状况研究[J].浙江预防医学，2010,22（1）：20，21，31.

［6］CaiT,JiangL,YangC,etal.Applicationofreal-timePCRforquantitativedetectionofVibrioparahaemolyticusfromseafoodineasternChina［J］.FEMSImmunolMicrobiol,2006,46:180-6.

［7］徐晓可，吴清平，张菊梅，等.水产品中副溶血性弧菌特异性二重PCR检测方法的研究[J].食品与机械，2008，24（3）：90-93.

［8]高学祥.副溶血性弧菌PCR快速检测[J].实用预防医学,2009,16（4）:1261-1263.

［9］XiaoyanLuan，JixiangChen，YuLiu，etal.RapidQuantitativeDetectionofVibrioparahaemolyticusinSeafoodbyMPN-PCR［J］.CurrMicrobiol,2008,57:218-221.

［10］葛菲菲,徐锋,沈莉萍,等.副溶血性弧菌PCR检测方法的建立［J］.中国预防兽医学报，2008，30（3）：229-232.

［11］俞春松.荧光定量PCR检测食品中副溶血性弧菌方法的建立［J］.中国高等医学教育，2010，（5）：144-145.