扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析

扬州市结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变分析

王金富曾方林戴洁

（扬州市第三人民医院江苏扬州225000）

【摘要】目的：了解本地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因katG和inhA的突变特征。方法：利用基因芯片检测505例经鉴定为结核分枝杆菌的菌株异烟肼耐药基因，分析本地区katG和inhA基因突变特征。结果：katG基因315位点突变频率为79%（83/105），inhA-15位点突变频率为22.9（24/105），其中katG基因315位点联合inhA-15位点突变频率为2%（2/105）。结论：本地区MTB对异烟肼耐药基因突变中katG315（AGC→ACC）为最主要突变类型，inhA-15（C→T）次之。

【关键词】结核分枝杆菌；异烟肼；基因突变

【中图分类号】R378.911【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2018）30-0313-02

异烟肼（INH）对结核分枝杆菌（MTB）具有较强的杀菌作用，是治疗结核病重要的一线药物。近些年，INH的耐药率逐渐上升，全国抽样调查显示我国INH耐药率已达17.6%，属高耐药国家。

INH的耐药主要是由于基因突变造成，主要跟下列基因改变有关：过氧化氢一过氧化物酶基因katG、烯酸基载体蛋自还原酶基因inhA、NADH脱氢酶基因ndh、酮酸基酸基转移蛋自酶基因kasA、烷基过氧化氢酶基因ah-pC等[1]。本研究利用基因芯片技术对扬州地区结核分枝杆菌异烟肼耐药基因突变位点特征进行了分析，现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

收集我院2017年经传统固体培养，并经鉴定为结核分枝杆菌的菌株共505例。

1.2仪器与试剂

仪器：基因芯片检测配套仪器由北京博奥生物有限公司提供。试剂：传统培养和鉴定试剂由珠海贝索生物有限公司提供，基因芯片试剂由北京博奥生物有限公司提供。基因芯片检测katG基因315（AGC→ACC、AGC→AAC）和inhA-15（C→T）3个突变位点。

1.3方法

1.3.1痰液化处理将痰标本用4%的氢氧化钠（NaOH）溶液液化，液化好的上清液用于接种固体培养基和核酸提取。

1.3.2传统培养及鉴定培养严格按《结核病实验室检测操作规程》的要求进行，采用PNB和TCH进行鉴定，并定期用H37RV进行质控。

1.3.3核酸提取煮沸法提取核酸。

1.3.4基因芯片核酸进行PCR扩增，产物用杂交缓冲液处理后在芯片杂交仪上进行杂交，再用芯片洗干仪进行洗涤和甩干，最后用芯片判别系统进行扫描和结果判读，并详细记录判读结果和芯片信息。

2.结果

2.1耐药基因突变率

共检出105例菌株发生耐药基因突变，突变率为20.8%（105/505），katG基因单一突变为81例，inhA基因单一突变为22例，katG基因和inhA基因同时突变为2例。

2.2突变位点分析

katG315（AGC→ACC）单一突变70例，katG315（AGC→AAC）单一突变11例，inhA-15（C→T）单一突变为22例，katG315（AGC→ACC）联合inhA-15（C→T）突变1例，katG315（AGC→AAC）联合inhA-15（C→T）突变1例。

表耐INHMTBkatG和inhA基因突变谱及突变频率

3.讨论

MTB耐药性的增加，导致耐药结核病感染率逐年上升，加大了结核病防治的难度。许多研究表明，MTB耐药主要是由于相关耐药基因突变导致的，通过检测相关耐药基因是否发生突变，从而可推断该MTB是否发生耐药。基因芯片技术是近些年比较流行的一种基因检测的分子技术，其通过PCR技术对待测菌的基因片段进行扩增，将扩增片段与芯片杂交，即可得到基因突变位点和突变类型。该法具有快速、高通量、灵敏等特点，近来在MTB耐药检测中应用广泛，我们前期的研究[2]也验证了基因芯片在MTB异烟肼耐药检测中具有较好的应用效能。

研究表明，MTB对异烟肼耐药主要是由katG、inhA、ndh、kasA、ah-pC五种基因引起，以katG、inhA突变较为常见，超过80%的耐药由这两个基因突变引起[3]。博奥基因芯片基于上述研究，只检测五种基因中的katG、inhA，可检出大部分耐INH的MTB。多数研究数据表明不同地区的临床分离MTB异烟肼耐药基因突变频率存在差异[4]。katG基因编码过氧化氢一过氧化物酶，其可使INH活化为异烟酸，使MTB不能合成胞壁枝菌酸，破坏MTB的保护屏障[5]。katG基因突变后导致INH无法活化为异烟酸，从而导致MTB对INH耐药。InhA基因编码的烯酸基还原酶是INH作用靶点，活化的INH能与InhA酶相结合，阻碍分枝菌酸合成，干扰长链脂肪酸的缩合。InhA基因的点突变和缺失造成inhA高度表达，至所需INH浓度增高导致耐药性产生[6]。505例菌株共检出105例基因发生突变，以katG突变为主要突变类型，突变频率达79%（83/105）。与国内其他地区的报道相近[7，8]，但与西班牙的34.6%、俄罗斯的93.6%、香港的51%[9]存在一定的差距，这也证明了MTB耐药基因的突变存在明显的地区差异。本研究中，katG315（AGC→ACC）为最常见突变，突变频率为67.6%（71/105），与2015年的突变频率69.2%相近，可以认为katG315位点（AGC→ACC）突变为本地区最常见突变。24例检测到InhA基因突变，突变频率为22.5%，与吴雪琼[10]和欧维正等人的结果相近，与朱中元[11]的结果差异较大，但需要注意的是，InhA基因突变往往只引起低水平耐药。

本研究中，发现两例菌株发生katG315和inhA-15联合突变，联合突变往往被认为会导致高水耐药。有两例未能检测到katG基因315位点，存在katG基因缺失，过去的研究认为基因缺失也会导致耐药，但需要更多的研究来验证。

综上所述，本地区MTB对异烟肼耐药基因突变中katG315（AGC→ACC）为最主要突变，inhA-15（C→T）次之。

【参考文献】

[1]IsakovaZ.DistributionofmutationsintherpoB,katG,inhA,ahpCgeneofrifampicinandisoniazidresistantM.tuberculosisstrainsisolatedinKyrgyzRepublic[J].MolGenMikrobiolVirusol,2008,(4):36-38

[2]王金富,戴洁,曾方林,等.基因芯片快速检测结核分枝杆菌耐药性的效能分析[J].实用临床医药杂志,2016,20(19):81-82.

[3]HuiM,ChanEW,ChinML,etal.GenotypicrpoBandgyrAprofilesfordetectionofrifampicinandfluoroquinolonesusceptibilitiesofMycobacteriumtuberculosisisolatesdirectlyfromclinicalsputumspecimens[J].IntJAntimicrobAgents,2009,34(2):186-187

[4]Minime—linguopouF,Pierre-audigierC,Kassa-KelembhoE,etal.Rapididentificationofmultidrug-resistanttuberculosisisolatesintreatmentfailureorrelapsepatientsinBangui,CentralAfricanRepublic[J].IntJTubercLungDis,2010,14(6):782-785.

[5]AndoH,KitaoT,Miyoshi-AkiyamaT,etal.DownregulationofkatGexpressionisassociatedwithisoniazidresistanceinMycobacteriumtuberculosis[J].MolMicrobiol,2011,79(6):1615-1628.

[6]孙冰梅，车志宏.结核分枝杆菌耐药的分子机制及耐药基因检测方法的研究进展[J].山西医药杂志，2005,4(4):301-303.

[7]欧维正,陈峥宏,陈静,等.基因芯片技术检测贵州省结核分枝杆菌耐药基因KatG和inhA[J].中国人兽共患病学报,2015,31(7):655-658.

[8]吴妹英.基因芯片法对苏州市结核临床分离株INH耐药性快速检测价值的研究[C].中华医学会结核病分会2013年学术大会论文集.2013:217-222.

[9]乐军,张旻,张红梅,等.结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药相关基因突变的分子特征[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(10):950-955.

[10]吴雪琼,钟敏,张俊仙,等.PCR直接测序法分析结核分枝杆菌katG基因突变[J].临床检验杂志,2000,18(1):9-11.

[11]朱中元,邵寒霜,陈允凤,王海波.结核分支杆菌inhA基因突变的测序研究[J].中华结核和呼吸杂志,2001,24(1):48-51.