MCM7、p27在结肠腺癌中的表达及其临床意义的研究

MCM7、p27在结肠腺癌中的表达及其临床意义的研究

张明明1蒋颖恒2罗运生1夏涛1李威1甘涛

张明明1蒋颖恒2罗运生1夏涛1李威1甘涛1杨颢1崔健华1王韦吉1

（1柳州市人民医院胃肠外科545001）

（2柳州市人民医院中医内科545001）

【摘要】目的：检测结肠腺癌组织细胞中MCM7、p27蛋白的表达，探讨MCM7,p27二者表达异常与人结肠腺癌发生、发展的关系。方法：采用免疫组织化学SP法检测40例结直肠腺癌，30例结肠息肉等非癌病变组织中MCM7、p27蛋白的表达。结果：40例结直肠腺癌中MCM7蛋白的阳性表达率为100%，与正常对照组的表达差异有显著意义(P<0.001)。结直肠腺癌组中MCM7蛋白的阳性表达与组织学分级有关，高分化组均显著低于中、低分化组(P<0.05，P<0.05)。淋巴结转移组中MCM7蛋白的阳性表达显著高于无淋巴结转移组（(P<0.05）；癌组中P27蛋白的阳性表达为72.5%(29/40），P27蛋白表达水平高低与组织学分级有关，高、中分化组均显著高于低分化组（P<0.05)。癌组中MCM7蛋白的表达与P27呈负相关（r=-0.4920,P<0.01）。而MCM7和p27的表达均与结直肠腺癌的性别、年龄、肿瘤大小、组织学无关（P<0.05），p27的表达尚与淋巴结转移无关（P=0.9319）。结论：细胞复制准许因子MCM7蛋白的高表达和细胞周期检测点负调控因子P27蛋白的低表达可能涉及了人结直肠腺癌的发生和发展过程，MCM7蛋白的高表达与癌细胞的增殖、侵袭和转移有关，MCM7和p27蛋白的联合检测可作为评价结直肠腺癌细胞的增殖状态、预测结直肠腺癌临床预后、指导临床治疗的重要生物学指标。

【关键词】结直肠腺癌MCM7P27免疫组织

【中图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）25-0162-02

细胞增殖失控是恶性肿瘤的发生和侵袭、转移的最基本特征，而细胞周期中任何一个调控环节的失控都可导致细胞增殖的异常。微小染色体维持蛋白[minichromosomemaintenance(MCM)proteins]基因其编码的MCM蛋白家族是一组与准许启动DNA复制密切相关的蛋白质。其蛋白家族共同构成DNA复制许可因子，启动DNA复制，DNA复制一旦完成，即从染色体脱离，从而确保在每个细胞周期染色体仅复制一次，保证细胞复制的正常性和精确性[1]。P27作为细胞增殖的负调控因子，其表达失常可导致细胞异常增殖。我们采用SP法免疫组化技术检测人正常肺组织和结肠腺癌组织中MCM7、P27蛋白的表达，比较其相关性及其与结肠腺癌临床病理特征的关系，以探讨二者表达失常与人结肠腺癌发生、发展的关系。

材料与方法

1.病例来源：40例病例随机选自柳州市人民医院胃肠外科2000年1月～2012年12月手术切除的结直肠腺癌病例材料，结直肠腺癌的病理诊断、分级和TNM分类按2007年NCCN，结直肠腺癌组织学分类标准进行。其中：腺泡样腺癌12例，粘液腺癌6例，类癌2例，乳头状腺癌20例，女性病例12例。年龄范围：36～79岁。选取30例乳头状管状腺瘤、炎性息肉旁正常组织材料作为对照组。按NCCN2007结肠癌TNM分期标准分为Ⅰ期14病例;Ⅱ期10例,Ⅲ期13例,Ⅳ3例。其中伴有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者16例.40例腺癌患者术前均未行放、化疗。标本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，常规切片。

2.方法：（1）免疫组织化学检测：采用SP法，MCM7（47DC141）和p27（DCS-72.F6）单克隆抗体分别购自NeoMarkers公司和福州迈新生物技术公司，SP试剂盒（Kit-9710）购自福州迈新生物公司。MCM7和p27切片均需作微波抗原修复处理，免疫组化染色操作步骤按文献进行[2]。（2）结果判断：MCM7和p27蛋白检测以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性标志，MCM7、p27染色的判断参照Bukhlm等[3]提出的标准。计数≥500个肿瘤细胞，以细胞核内出现棕黄色颗粒且阳性细胞数＜10%为（－），10～30%为（＋），30～70%为（＋＋），＞70%为（＋＋＋）。用已知人乳腺癌MCM7和p27阳性切片作阳性对照，以PBS取代一抗作阴性对照。

3.统计学处理应用SPSS10.0统计学软件对所得数据行x2检验、秩和检验和Spearman等级相关分析，以P＜0.05为显著性检验水准。

结果

1.各组中MCM7,、P27蛋白的表达：MCM7蛋白阳性表达在于正常肺组织中仅在细支气管上皮偶见个别或小灶状细胞核阳性表达,但阳性数小于10%，而在结肠腺癌组织中定位于癌细胞的细胞核，灶状或弥漫性分布。P27在正常粘膜组织中表达于腺上皮细胞核和胞浆，在结肠腺癌组织中主要定位于癌细胞胞核,部分可见胞浆着色。两种蛋白在各组中的表达见表1。MCM7蛋白在结肠腺癌组中的阳性表达为100.00%，正常组中均为阴性表达。p27在腺癌组中（++）～（+++）阳性表达为32.00%（8/40），而正常组中（++）～（+++）阳性表达为100.00%（30/30）。经统计学处理，结肠腺癌组中MCM7蛋白的阳性表达显著高于正常组（P<0.001），而p27的阳性表达显著低于正常组（P<0.001）。

表1MCM7、P27在结肠癌和正常粘膜组织中的表达情况

2.MCM7、P27的表达与结肠腺癌的临床病理特征之间关系：MCM7、P27的表达与结肠腺癌临床病理特征的关系见表2。经统计学处理，结肠腺癌组中MCM7蛋白的阳性表达与组织学分级有关，高分化组均显著低于中分化组和低分化组(P<0.05,P<0.05)。淋巴结转移组中MCM7蛋白的阳性表达显著高于无淋巴结转移组（(P<0.05）；P27蛋白的阳性表达与组织学分级有关，高、中分化组均显著高于低分化组（P<0.05,P<0.05)。而MCM7和p27的表达均与结肠腺癌的性别、年龄、肿瘤大小、组织学无关（P>0.05），p27的表达尚与淋巴结转移无关（P=0.9319）。

表2MCM7、P27表达与结肠腺癌临床病理特征的关系

3.结肠腺癌MCM7与P27的表达的相互关系：结肠腺癌组中MCM7与P27表达的相互关系见表3。在P27阴性材料中而MCM7阳性者共11例。P27阳性而MCM7阳性者29例。经统计学处理，MCM7蛋白的阳性表达p27的表达呈负相关（r=-0.4920,P<0.01)

表3MCM7、P27之间的相互表达关系

讨论

在一个细胞周期中，DNA复制合成起始于一个特定的起点，作为启动此起始点的复制许可因子（RLF）包括了微小染色体维持蛋白家族、起始识别复合物（originrecogenitioncomlex，ORC）和细胞分裂蛋白6（CellpisionCycle6，Cdc6）。ORC作用如同一个停泊点，在G1早期，MCM、Cdc6等复制调节因子在此共同组合装配成前复制复合物（pre-Rc），从而在复制的起始点构建S期DNA复制的能力，MCM蛋白复合物MCM4/6/7与此复制起始点有规律的结合与释放从而调控DNA的复制。此前复制复合物被cdc7/dbf4激酶活化后将MCM激活，激活的MCM4/6/7结合cdc45后具有DNA解链酶活性，并可促进DNA聚合酶（polα）、PRA（replicationproteinA）、Dpbll蛋白与复制起点结合，启动DNA的复制［3］。此外，MCM蛋白是一种与DNA复制有关的解链酶，它与核及NTP结合水解所产生的能量破坏DNA双链的氢键而对双链DNA解旋，同时其解旋酶还有移位酶的作用，从而在MCM复制和延伸中起重要的作用，复制起始后MCM蛋白有选择性的破环，严格限制并确保基因组在每一个细胞周期仅复制一次[4]。因而，当MCM蛋白的表达调控异常导致MCM7蛋白高表达，同时存在着p27蛋白的低表达的状态下，DNA损伤的异常细胞绕过完整的细胞周期，可在S、G2、M期等处直接启动重复复制，有重复复制能力的细胞可逃逸细胞周期的多个限制点、避开细胞凋亡和DNA修复机制，导致异常复制和多倍体的形成，从而细胞癌变的发生。本组研究结果显示：肺腺癌组中MCM7蛋白的阳性表达显著高于正常组（P<0.001），而p27的阳性表达显著低于正常组（P<0.001）。癌组中MCM7蛋白的表达与肿瘤的分化程度有关.即肺腺癌的中、低分化组均显著高于高分化组（P<0.0），提示组织分化程度越低,恶性程度越高，细胞增殖越旺盛，MCM7的阳性表达越强烈。此外，结肠腺癌组织中p27蛋白的阳性表达显著低于正常粘膜组织组(P<0.05)，高、中分化组中P27蛋白的阳性表达均显著低于低分化组（P<0.05)。癌组中MCM7与p27的表达呈显著性负相关，提示细胞复制准许因子MCM7调控异常和抑癌基因p27的低表达导致细胞的异常增殖可能涉及了人结肠腺癌的发生过程。

已知逃逸凋亡、持续复制电位、足够的生长信号、对抗生长信号不敏感、促进血管生长、浸润和转移是肿瘤细胞的基本特征。本组癌组中有淋巴结转移组MCM7蛋白的阳性表达显著高于无淋巴结转移组（(P<0.05），提示处于高增殖状态的肿瘤细胞更具备转移和浸润的能力。MCM7和p27蛋白的联合检测可作为评价结肠腺癌癌细胞的增殖状态、预测结肠腺癌临床预后、指导临床治疗的重要生物学指标。而针对复制准许因子MCM功能的抑制以阻断肿瘤细胞的增殖可引起特异的癌性细胞灭活作用或许可作为一种新的抗癌靶目标

参考文献

[1]SempleJW,DunckerBP.ORC-associatedreplicationfactorasbiomarkerforcancer[J].BiotechnolAdv-2004,22(8):621-631.

[2]LugrouL,NursP,cellcycle:Licensewithheld-GemininBlocksDNAReplication［J］.JCellSci,2000,290(5500):2271-2273

[3]Gonzalez.MA,PinderSE,CallasyG,etal.Minichromosomemaintenanceprotein2isa,strongindependentprognosticmarkerinbreastcancer[J].JClinOncol.2003,21(23);4306-4313

[4]LeiM，TyeBK.InitiatingDNAsynthesis：fromrecruitingtoactivatingtheMCMcomplex［J］.JCellSci，2001，114（Pt8）：1447～1454.

课题为广西卫生厅自筹经费课题