卵巢癌中EGFR表达和基因突变分析

卵巢癌中EGFR表达和基因突变分析

侯祥位陈立侠

侯祥位陈立侠

徐州中医院检验科江苏徐州221000

【摘要】目的：检测卵巢癌组织中表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorrecptor，EGFR）表达及基因突变的情况，为针对EGFR的靶向治疗在卵巢癌中的应用提供理论依据。方法：在医院取得卵巢70例卵巢癌组织标本，运用多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）及多聚酶链式反应-限制性内切酶片段长度多态性（PCR-restrictionfragmentlengthpolymor-phism，PCR-RFLP）分别检测卵巢癌组织EGFR基因是否有第19外显子的缺失及第21外显子的L858R点突变。结果：在70例卵巢癌组织中，PCR未检测到EGFR基因第19外显子缺失突变，PCR-RFLP未检测到第21外显子的L858R点突变。结论：卵巢癌组织EGFR基因中未检测到第19外显子缺失突变和第21外显子的L858R点突变。

【关键词】卵巢癌；基因突变；表皮生长因子受体基因

引言：卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。但是卵巢上皮癌死亡率却占各类妇科肿瘤的第一位，对妇女生命造成非常严重的威胁。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占百分之三十，大多数已扩散到子宫，双侧附件，大网膜及盆腔各器官，所以在早期诊断上是一大难题。

一、材料与方法

（一）标本来源

取2008年02月至2014年06月医院手术切除并经病理证实的70例卵巢癌组织作为研究样本。患者年龄15-71岁，中位年龄53岁。其中上皮性卵巢癌61例（包括46例浆液性卵巢癌、11例黏液性卵巢癌、1例移行细胞癌、2例透明细胞癌和1例子宫内膜样癌），生殖细胞癌5例（包括4例无性细胞癌和1例未成熟畸胎瘤），转移性卵巢癌4例。患者术前均未进行任何化疗或放疗。上海同济医院提供的2例NSCLC的DNA模板为阳性对照，其EGFR基因有第19外显子E746-A750缺失突变（即第746-752位密码子的碱基缺失）及第21外显子L858R点突变。

（二）引物合成

根据Genebank公开发表的人EGFR基因序列（编号NG007726），利用ligo6.0软件针对EGFR的第19和第21外显子设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列见表1。

（三）酚-氯仿法抽提卵巢癌组织中DNA

切除肿瘤石蜡组织周围多余石蜡后，将3-4片约5mm厚的组织切片放入1.5ml的离心管中，加入二甲苯脱蜡，微微摇动，换液3次。用无水乙醇水化脱二甲苯，换液3次，晾干。于离心管中加入消化液，37℃消化过夜，然后用酚-氯仿法抽提消化后肿瘤组织中的DNA。于抽提出的DNA中加入抗-DNA磁珠和裂解液，震荡混匀，并静置10min，置管于磁性台架使磁珠聚集，然后去除上清液。再于管内加入洗涤液洗涤，置管于磁性台架洗去非特异性结合物质，重复此操作1次。最后加入洗脱液洗脱吸附在磁珠上的DNA，将含有DNA的上清液回收至新的1.5ml离心管中，放置-80℃冻存备用。

（四）PCR扩增EGFR基因第19外显子和第21外显子

PCR反应体系：在20μlPCR反应体系中，加入DNA模板2μl，10×PCR缓冲液2μl，MgCl21.4μl（25mmol/L），4种dNTP0.4μl（10mmol/L），上下游引物混合物0.2μl（25mmol/L），TaqDNA聚合酶1U，用双蒸水补足反应体积至20μl。PCR循环参数：预变性95℃、4min，95℃、30s，56℃、30s，72℃、1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。EGFR基因第19外显子与阳性对照（NSCLC组织DNA）PCR扩增产物行2%琼脂糖电泳。EGFR基因第19外显子突变为缺失突变，缺失片段长12～20bp。EGFR基因第21外显子扩增产物进行后续检测。

二、结果

（一）EGFR基因第19外显子未发现缺失突变

70例卵巢癌组织EGFR基因第19外显子的PCR扩增产物经电泳检测均显示为243bp的单一条带，未见低于243bp的条带（图1）。而阳性对照的NSCLC组织EGFR基因第19外显子的PCR扩增产物的电泳显示为2条带，一条和卵巢癌的条带一致，为243bp，一条长度为228bp。因此，卵巢癌组织的EGFR基因第19外显子未发现缺失突变。

（二）EGFR基因第第21外显子未发现点突变

将卵巢癌组织EGFR基因第21外显子扩增产物经MscⅠ酶切后，2%琼脂糖电泳检测，L858R点突变的阳性对照NSCLC有3条条带，长度约217bp、151bp和66bp（图2），卵巢癌组织则为2条条带，长度为151bp和66bp，提示所检测卵巢癌中EGFR基因第21外显子没有L858R位点突变。

结语：卵巢癌临床分期越晚、组织学分化越差，EGFR阳性表达率越高，阳性表达率与临床分期及组织学分级有关，与病理类型无关。卵巢癌中未检测到EGFR基因第19、21外显子的突变。卵巢癌中EGFR蛋白高表达和EGFR基因第19、21外显子突变无关。虽然在卵巢癌EGFR第19、21外显子中未检测到基因突变，不能说明在卵巢癌中酪氨酸酶抑制剂的作用和酪氨酸激酶区域的突变无关，这可能和酪氨酸激酶区域其它外显子的突变有关，有待于进一步研究，对酪氨酸激酶编码区域的其它外显子系列进行测序，以待发现突变位点及突变类型。为针对卵巢癌的靶向治疗药物提供理论依据。

参考文献：

[1]颜笑健，梁立治，曾宗渊，刘继红，袁颂华，魏梅.铂类化疗敏感型卵巢上皮癌复发的影响因素[J].癌症，2015，24（06）：751-754.

[2]张新勇，徐丽艳，汪惠，朱允中，刘喆，岳文涛，等.EG-FR基因突变与酪氨酸激酶抑制剂疗效及预后之间的关系[J].中国肺癌杂志，2011，11（02）：206-213.