头孢克肟颗粒微生物限度检查的方法学验证

头孢克肟颗粒微生物限度检查的方法学验证

刘佳

刘佳(广东省梅州市食品药品检验所广东梅州514000)

【摘要】目的建立头孢克肟颗粒的微生物限度检查方法。方法测定头孢克肟颗粒对5种试验菌株的回收率，并进行控制菌的检查。结果5种试验菌株的回收率均高于70%以上，控制菌阳性生长良好。结论通过试验证明该方法有效可行，可用于该品种的微生物限度检查。

【关键词】头孢克肟颗粒微生物限度检查回收率

【中图分类号】R927.11【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）32-0051-02

药品在生产、储存、流通等环节都可能受微生物污染，被污染药品对人体的生命安全存在极大的隐患，而采用合适的方法进行药品微生物检查，可准确地反映药品受污染的程度，并保证人民大众用药安全。头孢克肟为第三代口服头孢菌素，通过抑制细菌细胞壁合成而起杀菌作用，对多数β内酰胺酶稳定，许多产青霉素酶和头孢菌素酶菌株仍对本品敏感。近年来的研究表明，头孢克肟在治疗儿童上呼吸道感染，儿童急性化脓性中耳乳突炎，小儿细菌性肠炎有较好疗效。本试验的供试品溶液经低速离心处理后，拟采用薄膜过滤法及常规法进行头孢克肟颗粒的微生物限度检查，并根据《中国药典》2010年版验证试验要求进行方法学验证。

1试验材料

1.1仪器设备蒸汽灭菌器（DSX-280KB24，上海申安医疗器械厂）；电热鼓风干燥箱[(GF-9030(A)，上海迈捷试验设备]；霉菌培养箱（MJX-150，上海申贤恒温设备厂）；生化培养箱（SPX-80，上海海向仪器设备厂）；离心机（TDZ6B-WS，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；孔径为0.45μm±0.2μm醋酸纤维素滤膜（上海医药工业研究所，亚东分离器材厂）；STV2开放式薄膜过滤器（浙江宁海白石药检器厂）。

1.2菌种大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]和黑曲霉[CMCC(F)98003]，均由中国药品生物制品检定所提供。

1.3培养基及试剂营养琼脂培养基，玫瑰红琼脂培养基，营养肉汤培养基，蛋白胨（均由中国药品生物制品检定所监制），β-内酰胺酶（购于上海瑞齐生物科技有限公司）。

1.4稀释剂pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.1%蛋白胨水、0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液均自配。

1.5试药头孢克肟颗粒A、B、C三个厂家，分别为深圳致君制药有限公司、湖南紫光古汉南岳制药有限公司、广州白云山制药总厂，批号分别为B20120323、20120316、2120069（以下用数字1、2、3表示，规格50mg/袋。）

2实验方法

2.1菌液制备接种大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，30～35℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1mL含50～100cfu的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物到改良马丁琼脂培养基斜面上，培养5～7d，加入5mL0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液将菌液稀释至每1ml含50～100cfu的菌悬液。

2.2供试液制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml置匀浆罐，制成1:10的溶液，将1:10的溶液离心5分钟（500转/分钟），上清液为1:10的供试液。

2.3常规法取1:10供试液1ml注入平皿内，平行制备两个，倾注冷却至45℃的相应琼脂培养基(细菌计数用培养基为营养琼脂，霉菌、酵母菌计数用培养基为玫瑰红钠琼脂培养基)15～20mL，摇匀，凝固后，将平板倒置于规定的温度培养至规定的时间(细菌于30～35℃培养3d，霉菌、酵母菌于23～28℃培养5d)，做菌落计数。

2.5细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

2.5.1验证方法

（1）试验组根据上述两种方法的差异，加入各种试验菌的方法不同。a.按常规法，取1:10供试液1ml注入平皿后，于每皿中加入50～100cfu试验菌，每种试验菌各平行制备两份。b.采用薄膜过滤法，各试验菌50～100cfu在最后一次的冲洗液中加入，过滤，各平行制备两份。

（2）菌液组测定所加入的每种试验菌数

（3）供试品对照组分别取1:10供试液按上述两种方法操作，用于测定供试品本底菌数。

（4）稀释剂对照组供试液需经薄膜过滤特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，用相应的稀释液替代供试品，分别加入各试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的薄膜过滤法操测定其菌数。

2.5.2回收率测定

回收率按以下公式计算：

试验组回收率=[(试验组－供试品对照组)&pide;菌液组]×100%

稀释剂对照组回收率=(稀释剂对照组&pide;菌液组)×100%

按上述方法操作进行预试验，回收率结果（见表1、2）显示常规法（每皿1ml）的白色念珠菌、黑曲霉两种试验菌回收率和薄膜过滤法的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌三种试验菌回收率均高于70%。可见，头孢克肟颗粒的霉菌、酵母菌计数应采用常规法，细菌计数则应采用薄膜过滤法。按药典规定，进行了3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。在预试验结果的基础上，进行了第2、3次验证试验，3次独立平行试验回收率均高于70%(见表3)。

2.6控制菌检查方法的验证

大肠埃希菌的检查采用常规法进行预试验，结果发现未能在阳性对照组检出试验菌，可见常规法不适于进行头孢克肟颗粒的控制菌检查。因此采用薄膜过滤法重新进行试验。试验方法如下:

（1）供试品对照试验组取1:10供试液10ml2份，按薄膜过滤法操作，将滤膜取出接种于含2mlβ-内酰胺酶的胆盐乳糖增菌培养基（100ml/瓶）中，置35℃培养18～24h。

（2）阳性对照试验组取1:10供试液10ml，按薄膜过滤法操作，于最后一次的冲洗液中加入10～100cfu大肠埃希菌的菌悬液1ml，将滤膜取出接种于含2mlβ-内酰胺酶的胆盐乳糖增菌培养基（100ml/瓶）中，平行制备两份，置35℃培养18～24h。

（3）阴性对照试验组操作方法同（2），加入试验菌改为金黄色葡萄球

按药典要求，供试品对照试验组和阴性对照试验组均不得检出，阳性对照试验组必须检出阳性对照菌。三次平行验证试验结果（表4）均符合药典的验证试验要求，方法成立。

表4控制菌检查验证结果

3讨论

3.1上述验证试验结果表明可按常规法进行头孢克肟颗粒的霉菌及酵母菌计数，细菌计数和控制菌检查则宜采用薄膜过滤法。本实验建立了头孢克肟颗粒的微生物限度检查方法，该方法的阳性对照菌的回收率均在70%以上，解决了因药品本身抑菌作用的干扰问题，准确反映该药品品种的微生物污染状况。

3.2实验中发现配制成的1:10溶液有沉淀，如果直接取10ml用于薄膜过滤法，极易造成堵塞，因此采用低速离心5分钟（500转/分钟）后的上清液为供试液，提高实验的可操作性和结果的准确性及重现性。

参考文献

[1]梁雪芳，张东毅.清开灵与头孢克肟颗粒治疗社区小儿上呼吸道感染的成本与效果对比分析，临床医药实践，2012，04，292-294.

[2]肖林，饶晓花，顾衍，吴国民.头孢克肟治疗儿童急性化脓性中耳乳突炎疗效观察.中国药师，2011，08，1171-1172.

[3]侯朝阳.头孢克肟治疗小儿细菌性肠炎疗效观察.中国实用医药，2009，30，116-117.

[4]中国药典2010年版一部[S].2010：附录79.