核磁共振氢谱测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度

核磁共振氢谱测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度

宋元德1梁敏

宋元德1梁敏2

（1辽阳市食品药品检验所辽宁辽阳111000）

（2石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司河北石家庄050051）

【摘要】目的建立测定无对照品或者指示剂的羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度的快速、专属、简单的核磁共振氢谱方法。方法BrukerAVANCEIII600MHz核磁共振谱仪,在25℃、以重水为溶剂、观测频率600.137MHz、谱宽：4200Hz、90度脉冲宽度10.06μs、脉冲延迟时间1s、采样时间3s、高斯增宽因子0、线增宽因子0.2和采样次数64次的条件下采集试样的氢谱。结果分别对5.3-4.85ppm（葡萄糖环上的氢）和1.2-1.0ppm（羟丙基上的甲基氢）的积分面积比，测定的重复性实验的RSD为0.08%（n=6）。结论分析结果表明，在没有对照品或者指示剂的情况下，核磁共振氢谱法，可以用于羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度的测定和质量控制。

【关键词】核磁共振羟丙基-倍他-环糊精取代度

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）31-0087-02

1引言

环糊精（cyclodextrin,CD）是由数个D-吡喃葡萄糖构成的环状低聚糖，环糊精的最显著的特征是具有一个腔外亲水、腔内疏水并且具有一定尺寸的立体手性空腔。β-环糊精(β-CD)是由七个D-吡喃葡萄糖构成的环状低聚糖。目前，β-环糊精在医药领域有着广泛的应用，例如：提高药物分子的水溶性、稳定性等[1,2]。通过安全性试验证明环糊精毒性低，口服环糊精是安全有效的。但β-环糊精胃肠外给药有一定毒性，经肌肉给药后能形成溃疡，静脉给药可导致肾脏毒性和溶血作用[3]。为了解决静脉给药安全性、提高溶解性，需要对β-环糊精进行修饰，羟丙基-倍他-环糊精是β-环糊精的醚化衍生物[4,5]。HP-β-CD的结构式如图1所示，因为，每个β-CD分子中有七个D-吡喃葡萄糖残基，每个葡萄糖残基上有三个可被取代的羟基，所以，这样计算HP-β-CD的平均取代度为0-21。HP-β-CD平均取代度的不同，其各种性能参数也稍有不同。目前国际上使用HP-β-CD的平均取代度一般为4.0-6.0。

目前中国药典和欧洲药典中，用于测定HP-β-CD平均取代度的方法有气相色谱法、容量法及核磁法[6,7]。目前国内采用核磁共振方法测定HP-β-CD平均取代度还没有文献报道，本研究采用核磁共振氢谱（1H-NMR）方法，建立了一种快速、专属、简单，用于无对照品或者指示剂的HP-β-CD平均取代度测定的分析方法。

2实验部分

2.1仪器与试剂

AVANCEIII600MHz全数字化超导核磁共振谱仪（瑞士Bruker公司）。D2O（（D，99.9%），美国CIL）；三批羟丙基-β-环糊精（批号：130101、130102、130103；由石药集团中奇制药技术（石家庄）有限公司提供）。

2.2实验方法

测定温度：25℃；环境湿度：15RH%；观测频率：600.137MHz；谱宽：4200Hz；90度脉冲宽度：10.06μs；脉冲延迟时间：1s；采样时间：3s；采样次数：64次；高斯增宽因子：0；线增宽因子：0.2。分别准确称量不同批次羟丙基-倍他-环糊精10mg置于5mm的核磁共振样品管中，加入0.6毫升D2O振荡溶解，制成待测试样溶液。在上述的实验条件下，调整仪器参数，调谐、控温、匀场、采样，得到1H-NMR谱。在进行相位和基线调整，以水峰为内标，标记为4.75ppm，分别对5.3-4.85ppm（葡萄糖环上氢的化学位移）和1.2-1.0ppm（羟丙基上甲基的化学位移）分别进行积分，将得到积分值进行平均取代度的计算[7]。

A1：羟丙基上甲基氢的积分面积；A2：葡萄糖环上氢的积分面积；

3结果与讨论

3.11H-NMR测定羟丙基-倍他-环糊精（HP-β-CD）平均取代度方法的建立

3.1.1溶剂及内标峰选定

固体样品须配成溶液测试，合适的溶剂粘度小，对样品溶解性能好，不与样品发生化学反应或者缔合，其谱峰不与样品峰发生重叠。因为羟丙基-倍他-环糊精的水溶解性好，所以采用水作为溶剂，羟丙基-倍他-环糊精的1H-NMR谱见图2。内标物质应该具有较高的纯度和准确的含量，不与样品和溶剂发生化学反应或缔合，能溶于NMR溶剂，含有多个质子，具有易于识别的谱峰，最好有尖锐单峰[8]；本实验选取水峰作为内标峰，其化学位移定为4.75ppm，避免外加入的内标物质对实验结果的影响。

3.1.2采集时间的选择

足够的采样时间可以保证只有感应衰减信号能衰减完全，得到基底没有振荡的相应谱峰，从而提高分辨率[9]。以不同的采集时间采集图谱，实验结果发现采样时间大于2.4秒自由感应衰减完全。因此，实验可选取采样时间等于3秒。

3.1.3脉冲延迟时间的选择

弛豫过程是核磁共振现象发生后得以保持的必要条件。因此，实验中应选取合适的脉冲延迟时间，保证谱峰强度不会被饱和，这样有利于对谱峰进行正确的积分，得到准确的结果，在实验中，按照脉冲从短（0.03秒）到长（3秒）分别采样，然后对定量峰进行积分，其峰面积比A1/A2随脉冲延迟时间的变化如表2所示：结果发现，在0.5秒之前，随着脉冲延迟时间的增大，A1/A2增大；在脉冲延迟时间大于0.5秒后，A1/A2没有明显的变化，因此实验选取脉冲延迟时间是1秒。

3.1.4重复性实验

按2.2节的实验方法，以20130101批次羟丙基-倍他-环糊精（HP-β-CD）样品，在同一实验条件下，连续做6个1H-NMR，并以A1/A2峰面积比计算考察实验的重复性，结果见表2。

计算得到其相对标准偏差RSD=0.08%（n=6），表明实验的重复性较好。

3.2羟丙基-倍他-环糊精（HP-β-CD）平均取代度结果

取羟丙基-倍他-环糊精（HP-β-CD）（批号：20130101,、20130102、20130103），按照2.2节的实验方法，在同一条件下做1H-NMR图谱，通过公式计算得到20130101、20130102、20130103批次的平均取代度分别为：4.84,4.81,4.87。实验结果表明，利用核磁共振方法测定羟丙基-倍他-环糊精的平均取代度专属性较好，重复性较好，能够快速测定，对操作人员无人身危害等优点。

参考文献:

[1]DuchêneD[M].Newtrendsincyclodextrinsandderivatives,EditionsdeSanté,1991:11～18.

[2]UekamaK.PharmaceuticalapplicationsofmethylatedcyclodextrinsJ.Pharm.Int.,1985,6:61～65.

[3]高申[M].现代药物-新剂型新技术.北京：人民军医出版社,2002:35～40.

[4]BrewsterME,HoraMS,SimpkinsJW,etal.Useof2-hydroxypropyl-β-cyclodextrinasasolubilizingandstabilizingexcipientforproteindrugsJ.Pharm.Res,1991,8:792～795.

[5]袁超,金征宇.羟丙基环糊精性质.应用及前景展望[J].粮食与油脂,2009,1:4～6.

[6]ChinesePharmacopoeia,2005,Ⅶ-F-48.

[7]EP7.301/2009:1804.

[8]胡敏,胡昌勤,刘文英.核磁共振氢谱内标法测定茚地普隆的含量[J].分析化学,2004,32(4):451～455.

[9]KeelerJ[M].UnderstandingNMRspectroscopy.Wiley,2011:4-2～4-3.

(图1羟丙基-倍他-环糊精的结构示意图)

图2羟丙基-倍他-环糊精的1H-NMR谱

表1不同脉冲延迟时间对应的峰面积比（A1/A2）

表2羟丙基上甲基的积分面积（A1）与葡萄糖环上氢的积分面积（A2）比；

基金项目：科技部"十一五"重大新药创制(2011ZX09401-306).