聚合酶链反应(PCR)技术的操作及医学中应用

聚合酶链反应(PCR)技术的操作及医学中应用

徐秀娟

（黑龙江省农垦总局总医院黑龙江哈尔滨150088）

【摘要】聚合酶链反应(PCR)是一种在试管进行的简便而快速的特异性DNA体外扩增技术，其基本原理与细胞内DNA复制的相似，但反应体系相对比较简单。主要应用于传统培养方法不能及时准确检出或敏感性太低或培养时间长的病原体的检测。PCR扩增能力极强、灵敏性极高，微量的样品污染便有可能导致假阳性结果的出现，为此，在实验操作中应谨防污染的发生，并设置严格的对照，以提高PCR结果的正确性。

【关键词】聚合酶链反应技术；PCR;操作方法；应用

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】1007-8231（2016）14-0229-02

聚合酶链反应(PCR)技术是近年来发展起来的一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法。此法操作简单，可在数小时内对仅有几个拷贝的基因扩增放大百万倍。目前，PCR技术已渗透到分子生物学等的各个领域，在分子克隆、遗传病的基因诊断、法医学等方面得到了广泛应用。

1.PCR技术的基本操作

1.1PCR基本操作

1.1.1标准的PCR体系体积一般选用50～100μL，其中含有50mmol/LKCl，10mmol/LTrisCl(室温下pH值8.3)，1.5mmol/LMgCl2，100mmol/mL明胶或牛血清清蛋白(BSA)，上、下游引物各lμmol/L，4种dNTP混合物各200μmol/L，模板DNA102～105个拷贝，TaqDNA聚合酶2.5U。

1.1.2操作程序按以下程序，将各成分在0.5mL灭菌离心管内混合(按100μL反应体积计算)混匀后离心15s使反应成分沉至管底。加石蜡油50～100gL于反应液表面以防液体蒸发[1]。置反应管于95～97℃变性5～10min，冰浴冷却，加入TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL。于合适的温度和时间下进行循环25～30次。末次循环后，在延伸温度下再延时5～7min。反应结束后，短暂离心，吸取少量反应液进行电泳分析，剩余液体置4℃保存备用。

2.PCR扩增产物的分析法

根据研究对象和目的的不同，可采用不同分析法对PCR扩增产物进行分析。

2.1凝胶电泳分析法

PCR产物可通过琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，后者灵敏度远高于前者，但配制方法复杂，故常用前者。做琼脂糖凝胶电泳时可用单一琼脂糖凝胶来分析，亦可使用混合低熔点琼脂糖凝胶，此种混合胶的熔点低(＜65℃)，而强度增加，易于操作，但低熔点琼脂糖过于昂贵[2]。在配制琼脂糖时加入0.5μg/mL的溴化乙锭（EtBr）或电泳后凝胶用同样浓度的EtBr液染色20min，然后用去离子水漂洗2次，每次15min，于UV灯下观察结果并拍照。凝胶电泳不仅可鉴定产物的大小，检测扩增情况，还可用于纯化扩增产物。

2.2斑点杂交分析法

当扩增产物为多条带时用斑点杂交较合适。将PCR扩增产物固定于尼龙膜或硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射性标志物标记的与产物部分或全长核苷酸序列互补的探针进行杂交。点杂交不仅可提高检测灵敏度（提高约一个数量级），而且还有助于检测突变DNA的突变类型，用于人类遗传病诊断和某些基因的分析。放射性核素（32P、35S等）标记的寡核苷酸探针检测的灵敏度高、特异性好且方法可靠，但由于放射性核素不稳定且有放射性危害，所以，不能用于临床或法医学的常规检测[3]。而用非放射性物质（生物素、荧光素和地高辛等）标记的寡核苷酸探针分析PCR产物可达到与放射性核素标记法相似的灵敏度，且非放射性标志物稳定性高，使用方便安全，检测速度快。

2.3微孔板杂交法

有两种方法。一种是夹心杂交法，即通过一固定于微孔板的捕获探针与PCR产物的某一区域特异杂交，使产物间接地固定于微孔板上，然后再用生物素等非放射性标志物标记的检测探针与产物的另一区域杂交，漂洗后显色即可判断结果。另一种方法不是采用夹心杂交法，而是直接将特异探针固定于微孔板上，然后用生物素标记的PCR产物与之杂交。该法与膜印迹杂交相比具有易操作、漂洗时间短、本底低等优点。

3.PCR技术在医学中的应用

PCR可广泛应用于各生物学领域。①扩增各种基因,用于基因重组、蛋白表达、构建cDNA文库，目前所用的基因工程生物产品，绝大多数是通过PCR方法获得的目的基因。②测序,可以很快测出常规PCR产物或单链DNA的序列。③用于分子进化和种系发育的研究,因为在一些大分子序列中含有足够的进化信息，通过PCR对其编码基因的扩增，并与较近或较远的种系比较，研究其分子进化及种系发育[4]。④分析和诊断遗传性疾病,根据遗传性疾病基因的缺失或突变对其做出诊断，如甲型血友病、苯丙酮尿症和地中海贫血等。⑤HLA基因的多态性分析,用于器官移植的配型等。⑥基因突变和重组研究,阐明基因突变对蛋白质功能的影响。⑦临床目前主要是用于感染性疾病的诊断。

3.1在感染疾病中的应用

在感染性疾病的诊断中，尤其是当血清学不能明确判断时，PCR可以确证感染的存在：①各种传染性疾病均可进行病原学确证诊断，但如果能用血清学方法诊断的病原体感染，一般不用PCR方法诊断。②对病原体进行基因分型和同源性比较，研究病原体的地区分布、基因变异，从而指导临床治疗。③克隆病原体各种蛋白质的基因，用于蛋白表达，纯化后制备血清学诊断试剂或疫苗。④发现新的病原体，如HCV、HBV、TTV和SENV。通过对未知病原体肝炎患者的血清进行随机引物PCR扩增，将扩增产物的序列与其他已知病原体基因序列比较而发现新病原体。⑤克隆病原体各种基因，建立基因表达载体，用于基因治疗。

3.2PCR在诊断病原体感染时的优缺点

PCR在对病原体感染的诊断方面有许多其他诊断方法无法比拟的优点，但也存在一定的不足之处。

3.2.1优点①灵敏度高。理论上，只要标本中有一个分子的DNA或RNA就可以做出诊断，HBV感染的诊断中，在适合的条件下PCR的敏感性为100份/mL，而斑点杂交的敏感性为105份/ml。②特异性强。对于一个有20个核苷酸的引物来说，非特异性配对的概率为1/420。PCR可以克服血清学诊断有交叉反应的缺陷。③可以早诊断。例如，在HCV感染中，第一周内就可通过PCR检测出HCVRNA，而抗体的产生一般在第二周以后。④对免疫力低下或使用免疫抑制剂而无抗体产生者，PCR可以做出明确诊断。⑤对病原体可定量分析，反映病原体在机体内的复制及动力学变化，并可对病原体进行基因分型及其观察，指导临床治疗。

3.2.2不足之处①操作复杂，技术不易被熟练掌握；②价格昂贵；③由于敏感度高，操作步骤多而复杂，常有污染情况发生，即使污染极少也会造成假阳性，稍有差错就会出现假阴性。专科化培训在低年资护士培训中的应用

【参考文献】

[1]张捷.定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值[J].中华检验医学杂志,2001.24(1):60-61.

[2]萧剑锋，唐北沙，谢光洁，肖波，夏家辉.聚合酶链反应技术在腓骨肌萎缩症基因诊断中的应用[J].中华医学杂志,2001,81(3):138-141.

[3]王和平，郑跃杰，陈小文，马卓娅，卢志威.聚合酶链反应检测技术在百日咳诊断中的应用研究[J].现代检验医学杂志,2010,25(1):37-40.

[4]王非，蒋建一，华炯刚，母安雄，谷根林.聚合酶链反应技术及其应用[J].动物医学进展,2006,27(6):103-107.