耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1β内酰胺酶耐药基因的探讨

耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1β内酰胺酶耐药基因的探讨

邢黎1李平2

1.栖霞市人民医院山东烟台265300；2.山东大学附属省立医院山东济南250021

摘要：目的探讨KPC和NDM-1β内酰胺酶耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的耐药基因。方法本次研究对象来源于我院出现的30株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，开展药敏试验、碳青霉烯酶检测、金属β-内酰胺酶检测、AmpC酶三维试验、基因检测及DNA测序等试验并检测基因，分析KPC和NDM-1β内酰胺酶的耐药基因。结果30株100%耐药于亚胺培南、美罗培南及头孢类药物，Hodge试验阳性率为90.0%，EDTA-2Na纸片协同试验阳性率为26.7%，AmpC酶三维试验阳性率为23.3%，耐药基因检测阳性率为56.7%，均携带KPC-2，无NDM-1基因。结论携带KPC型碳青霉烯基因为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌主要耐药机制。

关键词：耐碳青霉烯类；肠杆菌科细菌；KPC；NDM-1β内酰胺酶；耐药基因

碳青霉烯类抗生素包括美罗培南、亚胺培南等为临床治疗革兰阴性杆菌的常用药物，尤其是治疗持续高产AmpC酶（C类头孢菌素酶）和产ESBLs（超广谱β内酰胺酶）等革兰阴性杆菌感染的主要药物，亦被当做最后防线[1]。临床逐渐增加该类抗生素的使用范围与次数，致使临床肠杆菌科细菌敏感性不断降低，甚至陆续出现耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌。耐药菌株主要特点在于易播散且治疗药物有限[2]，在极大程度上影响临床感染治疗效果。为减少临床耐碳青霉素烯类肠杆菌科细菌数量，强化临床治疗效果，本文现选取30株耐药菌株，开展多项试验分析其耐药基因，便于临床更好预防耐药现象，详述如下。

1资料与方法

1.1一般资料

本次研究对象来源于我院ICU2015.2～2016.2出现的30株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，其中肺炎克雷伯菌为25株，大肠埃希菌2株，霍氏肠杆菌2株，产气肠杆菌1株，均来自ICU住院患者引流液、痰液、胸水、血液、导管及分泌物标本，应用细菌鉴定药敏仪明确30株菌株菌种。

1.2一般方法

准备好下列仪器与试剂：M-H干粉、美罗培南与亚胺培南药敏纸片、DNAladder与PCR试剂、PCR扩增仪与细菌鉴定药敏仪、DNA测序仪。

1.2.1药敏试验采用细菌鉴定药敏仪对抗菌药物敏感性予以检测，结合抗菌药物敏感性试验执行标准判断抗菌药物的敏感性，将耐美罗培南与亚胺培南菌株筛选出来，再对二者耐药性予以验证，主要应用纸片琼脂扩散法。大肠埃希菌为质控菌株。

1.2.2检测碳青霉烯酶主要方法为改良Hodge试验，依据抗菌药物敏感性试验执行标准推荐方法开展。将质控菌株菌液配制出来，其单位为0.5麦氏浊度，稀释液用1：10无菌生理盐水，在药敏试验平板上均匀涂好，干燥时间约4min，将美罗培南药敏纸片10μg贴在平板正中，接种环将待测菌3～5个挑出，接种时划线，起点为平板中心纸片边缘，终点为平板边缘，控制长度在23mm左右，培养液温度为35℃，过夜后观察结果。阳性为标准质控菌株交汇于待测株抑菌环处大肠埃希菌增长变强，反之则为阴性。产碳青霉烯酶KPC-2型肺炎克雷伯菌为阳性质控株，本组经测序比对与扩增后明确携带KPC-2基因。

1.2.3检测金属β-内酰胺酶应用亚胺培南-EDTA纸片协同试验，将EDTA.Na2溶液0.1mol/L配制出来，在空白纸片上取出5μl，在无菌状态下自然干燥。配制受试菌为106CFU/ml，在M-H平板上涂上菌悬液，将IPM纸片贴于完成接种的受试菌平板正中，将空白纸片与EDTA.Na2纸片分别在上下两端贴好，将CAZ与CTX纸片分别在IPM纸片左右贴好，任何纸片抑菌环扩大均判定为阳性，反之为阴性。

1.2.4AmpC酶三维试验将细菌酶液提取出来，主要应用反复冻融法，挑取待测菌落并在胰蛋白大豆肉汤12ml中接种，孵育箱增菌5h，温度控制在35℃，混匀。行离心处理，时间为25min，速度为4000r/min，反复冻融沉淀物，5次，温度为-70℃。将PBS1.5ml0.01mol/L加入并混匀，再次离心，取上清液，即得酶提取物。在涂有质控菌株菌液0.5麦氏单位的M-H平板中央将头孢西丁纸片贴上，而后无菌刀片挖槽，3mm宽，15mm长，放射状挖于平板边缘，避免触及底部。添加30μl酶液，孵育对结果予以观察。阳性标准为头孢西丁纸片与槽交界处矢状细菌生长区域，反之为阴性。

1.2.5基因检测加热煮沸将DNA模板制备出来，对NDM-1与KPC基因序列行PCR扩增，得到引物序列。依据推荐条件确定PCR反应体系，反应过程具体如下：预变性温度为95℃，持续时间为10min，而后变性处理，温度不变，时间持续30s，退火温度为55℃与52℃，时间均为30d，延伸时温度为72℃，持续30s。上述循环共开展30次，最后再行延伸，温度仍为72℃，持续时间为10min。1.2%琼脂糖凝胶电泳处理PCR产物，再染色，在紫外灯下放置对结果予以观察。选择阳性标本PCR产物，其大小等同于目标片段，分析DNA序列，结合序列比对将细菌基因型明确。

1.2.6DNA测序测序引物为PCR产物正向引物，应用全自动DNA测序仪，检索于生物信息中心获得DNA序列后再比较。

2结果

经药敏试验后发现30株100%耐药于头孢噻肟、头孢唑林、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林、氨曲南、氨苄西林等药物；行Hodge试验发现27株结果为阳性，占90.0%；EDTA-2Na纸片协同试验结果8株为阳性，占26.7%；AmpC酶三维试验结果7例阳性，占23.3%；耐药基因检测发现携带KPC型碳青霉烯酶基因17株，阳性率为56.7%；测序PCR阳性产物及比对后确认为KPC-2，无NDM-1基因。

由此可知，在30株分离菌中，Hodge试验27株阳性，KPC耐药基因检测17株阳性，金属酶试验8株阳性，AmpC酶三维试验7例阳性，其中除AmpC酶三维试验外另3种检查同时阳性共5株，除金属酶试验其他3种试验同时阳性2株，除KPC耐药基因检测外另3种检查同时阳性共2株，4个试验全部阴性者3株。

3讨论

机体多数肠杆菌科细菌为正常菌，随着临床广泛应用广谱抗菌药，不断增加耐肠杆菌科细菌，增加临床选择药物难度。碳青霉烯酶耐药性较强，且分布广泛，其属于β内酰胺酶，可强效水解碳青霉烯酶抗生素如美罗培南或亚胺培南等，有A、B、D几类，其中肠杆菌科分布最广泛的为KPC型，属A类。其耐药机制主要如下[3]：①A类碳青霉烯酶中KPC性最常见，B类为金属酶，IPM与VIM较常见；D类OXA类较少出现于肠杆菌科细菌中；②缺失外膜蛋白，联合将AmpC酶产出；③药物外排机制或药物作用靶位出现变化等。

KPC酶为新型碳青霉烯酶，已报道10个亚型。本组耐药基因检测发现56.7%携带KPC型，因该型酶编码基因介导载体为质粒，即使种属细菌不同亦可转播与转移，故而耐药菌株将其携带可能具备同源性，需进一步证实。NDM-1编码基因主要在质粒上，可传播于不同菌株，故而耐药广泛，但本组检测后未发现耐药基因。行改良Hodge试验阳性率为90.0%，临床已证实[4]该试验有较高的敏感度，可确证疑似产碳青霉烯酶细菌。但该试验不可避免的也存在假阳性现象，可能关联于菌株产AmpC酶或ESBLs数量较多。本组研究显示，携带KPC-2型碳青霉烯酶为耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌30株主要耐药机制，其中KPC耐药基因检测17株阳性，同时产AmpC酶为2株，同时产金属酶为5株，说明此7株耐药机制多样，经共同作用后发生。14株未将KPC检测出来，提示其耐药机制不同，可能为金属酶或AmpC酶。经药敏试验后发现30株100%耐药于头孢噻肟、头孢唑林、头孢吡肟、亚胺培南、美罗培南、哌拉西林、氨曲南、氨苄西林等药物，提示临床若发生耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌，可供选择的药物极少，甚至存在无药可选现象[5]。

综上所述，耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌感染为临床棘手难题，未来仍需深入研究，以对感染流行与暴发进行控制。

参考文献：

[1]俞刚，张肖，沈静等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC和NDM-1β内酰胺酶耐药基因的研究[J].中国感染与化疗杂志，2014，14（1）：38-41

[2]刘淑敏，许云敏，牛敏等.急诊重症监护病房耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分子流行特征[J].中国感染与化疗杂志，2015，15（4）：372-376

[3]谢小芳，沈海英，周惠琴等.耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌KPC-2与NDM-1基因的研究[J].中华医院感染学杂志，2014，（11）：2601-2603，2606

[4]徐丽英，丁卉，陈丽燕等.30株耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的调查分析[J].中华医院感染学杂志，2012，22（12）：2678-2680

[5]陈金云，傅鹰，杨青等.KPC-2及IMP-4酶介导肠杆菌科细菌碳青霉烯类耐药研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2015，（6）：419-426