融合PCR方法构建马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体

融合PCR方法构建马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体

王琳蓝秀万

王琳蓝秀万（通讯作者）（广西医科大学广西南宁530021）

【摘要】目的构建马尔尼菲青霉菌（Penicilliummarneffei,PM）的LIG4基因敲除载体，为敲除LIG4基和后期构建PM高效打靶系统提供基础。方法通过PCR扩增LIG4基因两翼基因片段及筛选标记基因pyrG基因片段，再用融合PCR方法扩增构建PMLIG4基因敲除载体，并酶切验证。结果用融合PCR成功构建了以pryG为筛选标记基因的PMLIG4基因敲除载体。结论马尔尼菲青霉菌LIG4基因敲除载体构建成功，为进一步同源从组敲除PM的LIG4基因构建高效打靶系统提供基础。

【关键词】马尔尼菲青霉菌融合PCRLIG4基因

【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）11-0099-02

由马尔尼菲青霉菌（Penicilliummarneffei,PM）是唯一温度依赖双相真菌青霉菌，引起人类系统性真菌感染性疾病，主要感染免疫缺陷患者，尤其是HIV感染者，易误诊，死亡率高[1]，近年来其致病分子机制成为研究热点。利用同源从组方法敲除马尔尼菲青霉菌DNA修复关键基因LIG4基因，可大大降低其非同源末端连接，从而提高同源重组效率[2]，构建一个马尔尼菲青霉菌基因高效打靶系统，为其基因功能研究提供有效的遗传操作工具。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及质粒：马尔尼菲青霉菌尿嘧啶营养缺陷菌株SPM4（实验室保存），大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa公司），质粒pGEM-Teasy（Promega公司)，含有pyrG基因质粒pLAX-223（实验室保存）。

1.1.2主要仪器：SIGMA台式高速冷冻离心机（仪器型号：3K-15，生产厂家：德国SIGMA），BIOMETRAPCR仪（仪器型号：Tpersonal，生产厂家：德国BIOMETRA），英国UVI凝胶成像分析系统（型号规格：7600Z，生产厂家：日本奥林巴斯公司）。

1.1.3主要试剂：Pfu酶（Takara），dNTP（Takara），Biospin胶回收试剂盒（BioFlux公司），MaxiPCRclean-upkit（天根天根生化科技有限公司），引物合成（上海生工生物工程有限公司）。

1.2方法

构建策略：设计引物，序列如下：LIG4-1F/LIG4-1R（5’-ACGGATGAGATCGTCGGGAC-3’/5’-GGACTTTGAGTGTGAGTGGAAATGTGTAACGGCAAAGGAGACTAGTCCAGGCAGCTATC-3/5’-CCGCAAGACGCTCACGCTTG-3’），LIG4-2F/LIG4-2R：（5’-TTGCCGTTACACATTTCCACTCAC-3’/5’-CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3’），pyrG-F/pyrG-R(5’-TTGCCGTTACACATTTCCACTCAC-3’/5’—CGCAGACAATGCTCTCTATCC-3’)。扩增质粒pLAX-223的pyrG基因和菌株SPM4中LIG4同源基因左右两翼基因LIG4-1和LIG4-2，用融合PCR的方法合成(LIG4-1)一pyrG一（LIG4-2）敲除载体基因片段，转化进入大肠杆菌，蓝白斑筛选,电泳鉴定，酶切检验。

1.2.1DNA分子操作

SPM4菌总DNA提取、纯化，质粒pLAX-223DNA提取、转化方法菌参照文献[3]。

1.2.2融合PCR

融合PCR原理及过程如图1。

第一轮：扩增LIG4基因两翼基因LIG4-1,LIG4-2：LIG4-1F/LIG4-1R：，LIG4-2F/LIG4-2R引物各1μ，SM4总DNA1μl为模板1μl，Pfu酶0.5μl，PCR程序：95℃×5min，（94℃×30s，55℃×30s，72℃×6min）×30个循环，72℃×10min。

第二轮：扩增pyrG基因：pyrG-F/pyrG-R引物各1μ，质粒pLAX-223为模板1μl，Pfu酶0.5μl，PCR程序：95℃×5min，（94℃×30s，58℃×30s，72℃×5min）×30个循环，72℃×10min，4℃store。两次PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳，用高载量PCR纯化试剂盒回收基因。

第三轮：扩增融合基因(LIG4-1)一pyrG一（LIG4-2）：分别用两次纯化后LIG4-1,LIG4-2，pyrG基因为模板各2μl，LIG4-1F/LIG4-2R为引物各1μlP，Pfu酶0.5μl。PCR程序：95℃预变性5min，（94℃×30s，54℃×30s，72℃×6min）×5个循环；（94℃×30s，52℃×30s，72℃×6min）×5个循环；（94℃×30s，60℃×30s，72℃×6min）×20个循环；72℃×10min。PCR产物纯化后取样电泳观察，用Biospin胶回收试剂盒切胶回收目标片段。

1.2.3重组质粒电泳鉴定

挑取转化后蓝白斑筛选白色菌落，挑取培养，提取质粒，电泳分析筛选阳性克隆。

1.2.4酶切验证重组质粒

重组质粒用XbaI、HindII双酶切。酶切体系(50μl)：重组载体10μl，HindII和XbaI各0.5μl。

2结果

2.1融合PCR合成(LIG4-1)一pyrG一（LIG4-2）敲除载体基因片段，电泳纯化后融合PCR目标产物，结果如图2，可见目标片段清晰完整。

2.2重组质粒电泳鉴定

以蓝色菌落质粒为对照，若成功插入外源基因，则相对空白对照质粒变大，电泳速度慢，电泳结果如图（3.1），可见比空白对照大的质粒，表明外源基因插入成功。

2.3重组质粒酶切验证

为了验证插入位点正确性，酶切鉴定重组质粒，预期酶切后应约为4.3kb、3kb和0.8kb三个基因片段，电泳结果如图（3.2），可见在4.3kb、3kb和0.8kb处左右出现清晰目标条带，表明外源基因插入位点正确。

3讨论

真核生物中修复DNA双链断裂的两个主要的重组途径：非同源末端连接（nonhomologousendjoining,NHEJ）和同源重组（homologousrecombination,HR）[4]。大多数真菌优先使用非同源末端连接。所以在转型过程中，外源DNA是主要被随机整合到到基因组中从而导致基因敲除和目标质粒整合效率降低。真菌非同源末端连接重组途径需要的基因Lig4的缺失已被证明以显着减少外源DNA片段非同源整合的频率，这大大改善针对性基因敲除的整合效率[5]，进年在真菌中发展的一个高效基因敲出系统，在真菌基因研究中得到广泛应用。LIG4基因敲除载体可以利用同源重组替换LIG4基因，从而降低PM非同源重组效率，从而为建立一个高效的打靶系统提供前提。

本实验通过融合PCR技术，成功构建了LIG4基因敲除载体。融合PCR过程中引物的设计、退火温度、酶的活性、模板的比例等多方面因素影响融合PCR结果。引物设计时应注意与两端拼接序列的共有部分对应，可以把这段序列作为基因内部一段序列来对待，整形引物是重叠区序列的一部分，而反向引物是重叠区的互补序列。融合PCR过程的三个退火温度，第一个退火温度是让接头区域互补配对合成融合基因，第三个退火温度是为了让全长引物与自我延伸得到的融合基因互补配对。尽管以PCR技术为基础对片段进行连接存在存在可能引入突变位点，但是在PCR过程中使用具有高保真性热稳定性聚合酶，以及优化反应条件，可以适当的减少错配的发生。融合PCR技术除了用于同源重组片段的构建，还可以用于长片段的基因的合成、突变基因的构建、基因的体外分子进化等研究。

附图

图1融合PCR原理示意图

Fig.1Fusion-PCRSchematicdiagram

图2融合PCR第三轮产物电泳图

Fig.2ThethirdroundoffusionPCRproductelectrophoresis

M:1kbDNAmaker

图(3.1)质粒电泳鉴定（3.2）质粒酶切验证电泳图

Fig.（3.1）Plasmidswereidentifiedbyelectrophoresis.

（3.2）Theplasmiddigestedverifyelectropherogram

（3.1）M为空白对照质粒，1和4为插入外源质粒；

（3.1）M为1kbmaker，1为验证质粒。

参考文献

[1]CooperCJ,HaycocksNG.Penicilliummarneffei:aninsurgentspeciesamongthepenicillia[J].JEukaryotMicrobiol,2000,47(1):24-28

[2]GoinsCL,GerikKJ,LodgeJK.ImprovementstogenedeletioninthefungalpathogenCryptococcusneoformans:absenceofKuproteinsincreaseshomologousrecombination,andco-transformationofindependentDNAmoleculesallowsrapidcomplementationofdeletionphenotypes[J].FungalGenetBiol,2006,43(8):531-544

[3]CahillD,ConnorB,CarneyJP.MechanismsofeukaryoticDNAdoublestrandbreakrepair[J].FrontBiosci,2006,11:1958-1976

[4]SchiestlRH,ZhuJ,PetesTD.Effectofmutationsingenesaffectinghomologousrecombinationonrestrictionenzyme-mediatedandillegitimaterecombinationinSaccharomycescerevisiae[J].MolCellBiol,1994,14(7):4493-4500

[5]GoinsCL,GerikKJ,LodgeJK.ImprovementstogenedeletioninthefungalpathogenCryptococcusneoformans:absenceofKuproteinsincreaseshomologousrecombination,andco-transformationofindependentDNAmoleculesallowsrapidcomplementationofdeletionphenotypes[J].FungalGenetBiol,2006,43(8):531-544

[6]YuJH,HamariZ,HanKH,etal.Double-jointPCR:aPCR-basedmoleculartoolforgenemanipulationsinfilamentousfungi[J].FungalGenetBiol,2004,41(11):973-981

基金项目:广西科学基金资助（合同编号：桂科青0991031）