免疫过氧化物酶法检测猪瘟病毒滴度

免疫过氧化物酶法检测猪瘟病毒滴度

钱浩洲李昕张景海

钱浩洲李昕张景海（沈阳药科大学110169）

【摘要】目的猪瘟病毒（CSFV）为黄病毒科瘟病毒属，是可以引发猪个体间和群体间高度接触性传染，对养猪业造成重大损失的病原。猪瘟的危害性包括：引起妊娠母猪流产、病猪败血症、慢性营养消耗和淋巴细胞及血小板减少等免疫系统病变[1]。猪瘟弱毒病毒能在乳猪肾细胞（MPK）中繁殖[2]，但不产生明显的细胞病变[3]。本研究采用免疫过氧化物酶法，体外检测猪瘟病毒滴度，并与体内法比较，以得到一种更为便捷、经济、稳定的测定猪瘟病毒滴度的方法。

【关键词】猪瘟病毒滴度免疫过氧化物酶法

【中图分类号】R155.5【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2014）35-0068-02

DetectionofCSFVTiterbyImmunoperoxidaseTest

HaozhouQianXinLiJinghaiZhang

（SHENYANGPHARMACEUTICALUNIVERSITY110169）

【Abstract】OBJECTIVES:Classicalswinefevervirus(CSFV)belongstothegenusPestiviruswithinthefamilyFlaviviridae,itisahighlycontagiousdiseasebetweeninpidualandgroup,itcausesgreateconomiclossinporkindustry.ThedamageofCSFVincludes:abortionofpregnantsows,septicemiaofpigs,chronicnutrientconsumption,reductionoflymphocytesandbloodplateletandotherimmunesystemdisease.CSFVcanbepassagedwithinminipigkidneycells(MPK)andhasnovisualcytopathic.ThisimmunoperoxidasetestisamethodtodetecttiterofCSFVinvitro.Comparingwithtestinvivo,itisamoreconvenient,economicandstablemethodtodetecttiterofCSFV.

【Keywords】CSFV;titer;immunoperoxidasetest

1.材料和方法

1.1材料

1.1.1猪瘟病毒C株、MPK细胞（乳猪肾细胞）猪瘟病毒C株购自中国药品生物制品检定所，由本实验室建立病毒库并保存；MPK细胞购自ATCC（美国菌种保藏中心），由本实验室建立细胞库并保存。

1.1.2试剂DMEM培养基和胰酶购自GibcoBRL公司，胎牛血清（FBS）、马血清（HorseSerum）购自Hyclone生物公司，辣根过氧化物酶标抗体（HRPOconjugate39.5）购自瑞士Prionics公司，PEG（1500g/mol）、3-氨基-9-乙基-咔唑（AEC）、N,N-2-甲基-甲酰胺、吐温-80（Tween-80）购自Sigma公司，30%过氧化氢购自国药集团化学试剂有限公司，PBS、0.05M醋酸钠、0.15M氯化钠、Bari2培养基为本实验室自配。

1.2方法

1.2.1免疫过氧化物酶法

1.2.1.1细胞培养生长良好的MPK细胞一瓶，胰酶消化2-3min，以3*105/ml的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔200μl，在37℃、3%CO2条件下于含有10%FBS的Bari2培养基中培养5d，得到单层贴壁细胞。

1.2.1.2猪瘟病毒的培养收获猪瘟病毒在MPK细胞中扩增后破壁释放而出，回收经生物反应器连续培养的病毒收获液，样品置于4℃冰箱中保存不超过24h。

1.2.1.3单层接毒将病毒收获液原液用含有2%PEG的Bari2培养基进行梯度稀释，取10-2到10-5的4个梯度；弃去96孔板中的培养基上清液，每孔加入病毒稀释液100μl，每个梯度4孔，置于37℃，3%CO2的培养箱中孵育4h后，将培养基换为含有2%FBS的Bari2，每孔200μl，继续于37℃，3%CO2的培养箱中培养4d。

1.2.1.4免疫过氧化物酶法检测病毒滴度弃去96孔板中的培养基上清液，用0.15MNaCl清洗1次，置80℃恒温干燥箱中热固定1h；取出后用0.15MNaCl清洗1次，避光加入80倍稀释的HRPOconjugate39.5，每孔50μl；避光于37℃恒温加湿培养箱中孵育1h；取出后用含0.05%Tween80的PBS清洗五次，避光加入AEC底物，每孔50μl，室温避光孵育2h后于倒置显微镜下观察。

1.2.2体内法将病毒进行梯度稀释，取10-3到10-6的4个梯度，耳缘静脉注射洁净级别的实验家兔，每梯度4只，每只注射1ml，48h-96h内每6h测量一次体温，根据体温变化判定病毒滴度。

2.结果

2.1免疫过氧化物酶法阳性结果的判定染色后的被感染细胞呈现红色，核质分明，记为阳性(见图1)；细胞表面出现红色团块，没有明显的核质结构，为染色不均造成的假阳性结果；细胞未被染色，记为阴性。

图1免疫过氧化物酶试验阳性结果，细胞核质结构清晰可见

2.2体内法阳性结果的判定猪瘟病毒接种实验家兔不会引起典型的猪瘟症状，被感染兔体呈现出发热的症状。接种猪瘟病毒后48~96h内，兔体体温最少3次上升1℃以上，并持续18~36h为典型热反应（++）；接种后48~96h内，兔体体温最少2次上升0.5~1℃，并持续12~36h为温和热反应（+）；接种后24~48h内发生热反应，48h后，兔体体温没有明显上升或发热症状持续少于12h，为疑似热反应（±）；接种后，兔体体温正常，为无热反应（-）。

2.3滴度的计算

TCID50=>50%感染的病毒稀释度+>50%的百分数-50%*log10

>50%的百分数-<50%的百分数

RID50=>50%发热的病毒稀释度+>50%的百分数-50%*log10

>50%的百分数-<50%的百分数

2.4免疫过氧化物酶法和体内法结果对比选取10个猪瘟病毒传代培养收获液样品，分别用免疫过氧化物酶法和体内法检测病毒滴度，对比两种方法的结果（见表1）。

表1：免疫过氧化物酶法与体内法检测结果对比

3.讨论

本文采用两种检测猪瘟病毒滴度的方法，一种是体内法，一种是体外法。其中体内法用猪瘟病毒直接注射到实验家兔体内，通过家兔受到感染后体温的变化来判定病毒滴度，此种方法较为灵敏，但操作时所需人力物力成本较高，且对操作人员的专业技能要求较高，在实际应用中不易操作。而另一种体外法，即免疫过氧化物酶法，虽然在灵敏度上不及体内法，但操作简便，成本较低，且经过多次试验，其检测结果和体内法相比较，差异小于等于10TCID50/ml。此方法稳定、简单易行、成本低廉，可以应用于疫苗生产企业质量内控的过程中。

参考文献：

[1]王美君，侯艳红，倪娇，焦连国，孙雨，赵亚荣.猪瘟免疫失败的原因及其防制对策[J].中国畜牧兽医.2011(02).

[2]王镇，闵光伟，李明义，滕俊琳，丁明孝.猪瘟病毒的形态结构与形态发生[J].微生物学报.2000(03).

[3]田宏，刘湘涛，张彦明，林彤，吴锦艳，谢庆阁.猪瘟病毒及其致病机制研究进展[J].动物医学进展.2007(S1)