抗酸染色阳性痰标本结核分枝杆菌的快速检测

抗酸染色阳性痰标本结核分枝杆菌的快速检测

马卫国1吴海松1钟利2俞学锋2陈焯彬1黄

马卫国1吴海松1钟利2俞学锋2陈焯彬1黄寿盛1（1钦州市第一人民医院535000；2泸州医学院附属医院646000）

【摘要】目的快速鉴定泸州地区抗酸染色阳性痰标本中分枝杆菌的菌种。方法用PCR方法直接扩增抗酸染色阳性痰标本中分枝杆菌的特异性插入序列6110，琼脂糖胶电泳检测目的条带。将未能扩增出插入序列6110基因片段抗酸染色阳性痰标本进行培养。结果60例抗酸染色阳性的痰标本中，有7例未能扩增出插入序列6110基因片段，3例为初治病例，4例为复治病例；经培养鉴定均为非结核分枝杆菌，而肺结核伴合并症组与肺结核无合并症组两组相比IS6110检出率有显著性差异。结论利用分子生物学方法对临床痰标本进行检测，是一种简便快速的检测技术，可实现快速诊断，为临床的化疗提供帮助。

【关键词】抗酸阳性非结核分枝杆菌耐药性插入序列6110

目前在泸州地区尚无对分枝杆菌的菌种鉴定和耐药问题的相关研究，为此，我们设计插入序列IS6110特异引物，运用PCR法，对本地区临床诊断肺结核患者实际感染的分枝杆菌菌种及其利福平的耐药性进行实验性研究，以明确本地区抗酸染色阳性的标本中，非结核分支杆菌的比例以及利福平的耐药情况，以指导临床实际工作。

1.材料与方法

1.1实验材料

1.1.1痰标本

来自泸州医学院附属医院肺结核住院患者，并经附属医院检验科细菌室涂片抗酸染色明确查见抗酸杆菌++以上。

1.1.2标准菌株

人型结核杆菌标准菌株H37RV菌悬液，购自中国药品生物制品鉴定所。

1.2方法

1.2.1痰标本前处理

取痰样本1～3毫升加入4%NaOH与痰液5：1混合，液化；取0.5毫升的液化痰液，加0.5毫升4%NaOH，摇匀，离心，弃上清，沉淀物用pH7.4TE缓冲液洗，离心。取沉淀物用于DNA的提取，或-20℃冷冻。

1.2.2细菌DNA提取

取试剂盒沉淀物，加入180ul溶菌酶溶液，重悬菌液，加入20ul蛋白酶K溶液至细胞完全裂解。加入200ulBDBuffer水浴。加入200ul无水乙醇充分颠倒混匀。吸附柱中加入500ul漂洗液PW，离心，倒滤液。吸附柱中加入500ul漂洗离心，倒滤液。将吸附柱放入收集管中,离心，取出吸附柱，加入50ul预热（60℃）的洗脱液ElutionBuffer，收集DNA溶液。

1.2.3PCR扩增

根据Genebank中结核分枝杆菌标准菌株H37RV（登录号AJ749948）的IS6110基因序列，设计PCR反应引物[1]序列INS1：5′-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3′INS2:5′-GCGTAGGCGTCGGTGACAAA-3′，扩增IS6110基因片段。

1.2.4凝胶电泳

反应结束后取5ulPCR产物，2%琼脂糖凝胶电泳，后用凝胶成像系仪照相。

1.2.5将未能扩增出插入序列6110基因片段抗酸染色阳性痰标本，按全国结核病细菌学检验标准化规程进行分枝杆菌培养、菌种鉴定。

1.3统计分析

实验相关数据均采用SPSS14.0软件统计分析。卡方检验理论频数小于5，采用连续性校正x2检验或Fisher`sexacttest。

2.结果

2.1共有53例抗酸染色阳性痰标本中扩增出约245bp大小的特异性片段，对比标准菌株H37RV，与预期相符合，证实IS6110基因扩增成功（见图1）。

图1IS6110基因琼脂糖凝胶电泳图

注：图M为DNAMarker,范围为50～500bp；7为阴性对照，6为标准菌株H37RV，1～5为样本DNA。

2.2未扩增出目的条带7例中经培养鉴定为非结核分枝杆菌，因条件限制未进一步分型，3例为初治（合并艾滋病2例、糖尿病1例），4例为复治（其中有合并糖尿病1例、肾病综合征1例，2例无合并症），而临床诊断为肺结核合并糖尿病、艾滋病、肾病综合征、系统性红斑狼疮等组中有5例未出现目的条带，肺结核无合并症组有2例未出现目的条带，两者相比较IS6110阴性检出率有显著性差异(见表2)。

表2肺结核无合并症组与肺结核伴合并症组IS6110比较

(X2值=14.92,P值=0.001)

3.讨论

临床上检出痰中含有结核分枝杆菌是诊断肺结核病或鉴别肺结核与其他肺病的最重要依据之一。痰中结核分枝杆菌的检测方法常规采用痰涂片抗酸染色及痰结核杆菌培养。分枝杆菌培养需6～10周，不能满足临床需要，涂片染色法又不能有效区分结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌。因此本次实验中，我们采用抗酸染色阳性的临床痰标本，利用分子生物学PCR技术，扩增特异性IS6110基因片段，以鉴别临床诊断肺结核患者实际感染的分枝杆菌的种属[2]。本研究发现在60例抗酸阳性的痰标本中，有7例（11.7%，7/60）未能扩增出目的基因片段，提示可能为非结核分枝杆菌感染，略高于全国结核病流行病学抽样调查结果的NTM在分支杆菌分离株比例（11.1%）我们也发现，临床诊断肺结核无合并症组中，初治病例都扩增出目的条带，复治病例中有2例未扩增出现目的条带，由于我们的临床样本例数偏少，统计分析结果与实际情况可能存在差异，还进一需步增加样本量进行研究。因此初步认为本地区痰抗酸杆菌阳性的初治无合并症患者，结核分枝杆菌感染的可能性大，复治无合并症患者除了考虑结核杆菌耐药外，需重视非结核分枝杆菌感染的可能性。在合并其他免疫力低下的基础疾病如艾滋病、糖尿病，或长期使用免疫抑制剂的疾病如肾病综合症、SLE等病例中，未扩增出目的条带的比例（45.5%,5/11）明显高于无合并症肺结核组(4.1%，2/49)，两者相比较具有显著性差异，其中仅有的2例艾滋病患者均未扩增出IS6110基因片段，这提示我们在临床诊治有合并症的肺结核患者时，尤其是合并艾滋病，查见抗酸染色阳性时需高度重视非结核分枝杆菌感染可能，应进一步采用分子生物学或其他的相关技术以明确，避免延误病情[3]。

通过本实验，我们再次证实运用PCR法扩增特异性基因片段，可以在1～2天内快速鉴定临床肺结核患者所感染的分枝杆菌菌种，能大致了解本地区肺结核分枝杆菌的感染特点。整个实验所使用的技术操作简单，具有较高的灵敏性、准确性，符合临床实际工作需要，能对患者的病情诊断及药物治疗提供一定的帮助，有益于预防耐药菌在人群中的扩散。

参考文献

[1]万康林，刘敬华，张丽水，等，结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征初步分析[J]．中华流行病学杂志，2006，27(11)：973—976.

[2]ChangPL，HsiehWS，ChiangCL，eta1．IdentificationofinpidualDNAmoleculeofMycobacteriumtuberculosisbynestedPCR-RFLPandcapillaryelectrophoresis[J]．Talanta，2008，77(1)：182—188.

[3]SoumiteshC，TyagiJS．NovelMultipurposeMethodologyforDetectionofmycobacteriainpulmonaryandextrapulmonaryspecimensbysmearmicroscopy，culture，andPCR[J]．JournalofClinicalMicrobiology，2005；31(6)：2697-2702.