窖蛋白-1在脑与脊髓中的分布

窖蛋白-1在脑与脊髓中的分布

方俊杰

方俊杰（福建医科大学附属协和医院神经外科福建福州350001）

【中图分类号】R741.04【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）37-0035-02

【摘要】目的探讨窖蛋白-1在脑与脊髓中的分布。方法用免疫组化ABC法及Westernblot法研究窖蛋白-1在成年SD大鼠脑与脊髓中的分布与定位。结果窖蛋白-1广泛分布在成年SD大鼠的大脑皮质、小脑、脊髓和海马；主要表达于微血管壁，在胶质细胞中也多有散在的阳性细胞分布。结论窖蛋白-1在脑与脊髓中较为广泛的分布提示窖蛋白-1在脑与脊髓的功能活动中可能起重要作用。

【关键词】窖蛋白-1脑脊髓免疫组化Westernblot法SD大鼠

1953年Palade在电镜下发现血管内皮细胞表面有一些瓶状的内陷结构；两年后Yamada在膀胱上皮细胞表面发现类似结构．并将其命名为胞膜窖。胞膜窖直径约50～100nm,由胆固醇、鞘磷脂、鞘糖脂和脂蛋白构成，其化学本质介于无序液体和液晶之间，为去垢剂不溶性膜域[1，2]。窖蛋白是胞膜窖区别于其他脂质筏结构的特征性分子[3]。目前窖蛋白家族有三个成员：窖蛋白-1、2、3，其中，窖蛋白-1最早发现，研究的也最多。目前研究认为，窖蛋白-1在胞膜窖的形成和细胞内吞、胆固醇的运输和脂类稳定、细胞内外信号传导、血管的生成等过程中起重要作用，是胞膜窖的主要结构和功能成分。窖蛋白-1在内皮细胞、平滑肌细胞、骨骼肌肌母细胞、成纤维细胞和脂肪细胞中含量丰富，对于它在中枢神经系统中的分布与表达的研究还很少见。本研究用Westernblot法及免疫组化ABC法研究窖蛋白-1在成年SD大鼠脑与脊髓中的分布，希望为进一步探讨它在脑与脊髓中的功能提供实验资料。

材料和方法

1．试剂：兔抗Caveolin-1购自SANTA-CRUZ公司，羊抗兔免疫组化试剂盒购自武汉博士德公司，DAB显色试剂盒购自北京中山公司，Westernblot试剂盒购于德国KPL公司。

2．材料：健康成年雄性SD大鼠10只，体重180～220g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。

3．方法：

3.1窖蛋白-1Westernblot：

取大鼠5只，用10％水合氯醛麻醉后断头取脑。在解剖镜下准确取出海马、大脑皮质、小脑、脊髓，加入预冷的单去污裂解液200μl重悬组织，匀浆、离心，吸取上清，每组均取60g，加单去污裂解液补充各样本至相同终体积。按比例加入4.SDS上样缓冲液，煮沸5min，自然冷却至室温。上样,采用4％的浓缩胶，10％的分离胶进行丙烯酰胺凝胶电泳,直到溴酚兰在分离胶内泳动至电泳槽底部。切下蛋白标准品进行考马斯亮蓝染色。电转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜,用兔抗鼠多克隆抗体(1：200稀释度)孵育，再以HRP标记的羊抗兔IgG的抗体（1:2000稀释度）孵育膜，经曝光、显影、定影后，显示蛋白条带。

3.2窖蛋白-1免疫组化ABC法：

取大鼠5只，实验组用水合氯醛腹腔内注射麻醉，开胸暴露心脏，经主动脉灌注固定。先快速灌入生理盐水，再先快后慢灌入多聚甲醛。取材，并把组织块置入4％的多聚甲醛固定。恒冷箱切片机制作冠状切片，片厚10um。采用ABC法进行免疫组织化学反应。替代实验：以与一抗血清同浓度的正常兔血清代替一抗血清进行免疫组织化学反应。

结果

1.窖蛋白-1Westernblot：

蛋白印迹分析显示，第一至第五泳道膜上可见一条棕黑色的蛋白带。吸光度由高到低依次为脊髓、海马、大脑皮质、小脑。

2.窖蛋白-1免疫组化：

2.1实验组：

在大脑皮质，窖蛋白-1免疫阳性产物主要表达于微血管壁、血管周围脑组织中的胶质细胞和神经元。窖蛋白-1免疫阳性见于所有皮质微血管，血管壁染色层次较厚，染色均匀，可见到深染的细胞核。在皮质深部，窖蛋白-1免疫阳性细胞数量多，染色强，体积中等，细胞散在分布。神经胶质细胞从胞体至突起、从胞浆到细胞膜都有明显窖蛋白-1阳性染色，在细胞膜处染色较深，呈线状，胞浆染色较浅，分布较均匀；在神经元，窖蛋白-1阳性染色亦遍及胞浆和细胞膜，突起亦有染色，染色分布均匀。

在小脑，窖蛋白-1免疫阳性细胞主要分布于微血管壁、神经元和神经胶质细胞中；阳性染色遍及胞浆和细胞膜，突起染色较浅而少。

在脊髓，窖蛋白-1免疫阳性细胞亦主要分布于微血管壁，血管周围有散在胞体较小的胶质细胞，胞浆中有阳性表达，突起也被阳性染色。微血管数量众多，散在分布，阳性染色明显而均匀，血管壁可见深色的细胞核。

海马各区的胶质细胞有阳性表达。

2.2对照组：

空白对照实验和正常血清替代实验免疫组织化学反应均为阴性。

讨论

本研究用免疫组化ABC法及Westernblot法研究窖蛋白-1在成年SD大鼠脑与脊髓中的定位与分布，结果发现在大脑皮质、小脑和脊髓窖蛋白-1主要表达于微血管壁，在周围神经组织胶质细胞中也多有散在的阳性细胞分布；从胞体至突起，从胞浆到细胞膜都有分布。这种较为广泛的分布提示窖蛋白-1在脑与脊髓的功能活动中可能起重要作用。

本实验发现在大脑皮质和小脑的胶质细胞有窖蛋白-1表达，胞膜窖在神经胶质细胞中的存在对胶质细胞的功能具有十分重要的意义。胞膜窖可以通过饮液作用来浓缩和运输低浓度物质；它还具有内吞作用，运输多种大分子物质如血浆高密度脂蛋白颗粒、白蛋白等进入细胞内。神经胶质细胞可能通过胞膜窖来摄取由神经末梢所释放的钾离子，实现对钾的缓冲作用，从而参与神经冲动的发放过程；在中枢神经系统的损伤和修复过程中，神经胶质细胞可能通过胞膜窖来清除损伤和死亡的神经元，清除若干种细胞外基质成分，以促进修复的进行。再者，窖蛋白-1被许多研究认为具有分隔胞膜窖内的信号分子，聚集各种功能相关的蛋白质，形成细胞膜上局部的最适环境，以促进某种细胞生理作用的完成的功能；同时它还可以与许多蛋白直接作用以调节其功能[4，8，9]。

本实验中微血管壁有明显的窖蛋白-1表达，阳性染色层次较厚，这提示窖蛋白-1是血脑屏障结构的重要组成成分[4，5]。在功能方面，首先，内皮细胞控制着进出血管壁的物质和细胞的交换，作为大分子物质进入细胞的重要方式之一，胞膜窖介导的内吞作用正常与否将直接影响内皮细胞的运输功能[6]；其次，窖蛋白-1通过影响胞膜窖内的其他转运蛋白以调节内皮细胞的物质交换，如窖蛋白具有调节P-糖蛋白活性的功能，减少P-糖蛋白介导的物质转运[7]。

本实验在大脑皮质深部的锥体细胞中有窖蛋白-1表达，在小脑组织亦有以核淡染、核仁明显为特征的神经元样细胞免疫反应阳性，与既往研究结果不相符。既往研究多否定神经元中有窖蛋白-1表达，研究者既未发现神经元存在形态学可鉴别的胞膜窖结构；又未从神经元中检测到窖蛋白及其mRNA[10]。一方面考虑到随着生化技术的进步和所用试剂特异性和纯度的提高，原先为阴性的反应现在可能呈阳性，实验结果的不同是有可能的；另一方面考虑到免疫组化实验是一种形态学检验方法，根据免疫阳性染色的细胞各部分形态来判断细胞的类型，因此并非完全准确，可能有一定的偏差。如果能对经过培养纯化的神经元单独进行检测，那么实验结果将更有说服力。

总之，本研究发现在成年SD大鼠脑与脊髓有较为广泛的窖蛋白-1分布，窖蛋白-1主要表达于微血管壁和神经胶质细胞，在神经元亦可能有表达；从胞浆到细胞膜，从胞体到突起都有分布。本结果提示窖蛋白可能与血脑屏障的结构与功能、物质运输、信号转导等有关，为进一步探讨该蛋白的功能及其与疾病的联系提供了重要的形态学资料。

参考文献

[1]PaladeGE，eta1．JApplPhysio1．1953，24：1424-1436.

[2]YamadaE，eta1．JBiophysBiochemCytol，1955，l：445-458.

[3]GlenneyJRetal．ProcNaHAcadSciUSA，1992，89：10517-10521.

[4]CameronPL,RuffinJW,BollagR,etal.Identificationofcaveolinandcaveolin-relatedproteinsinthebrain[J].JNeurosci，1997，17(24):9520-9535.

[5]VirgintinoD,RobertsonD,ErredeM,etal.Expressionofcaveolin-1inhumanbrainmicrovessels[J].Neuroscience，2002，115(1):145-152.

[6]NusratA,ParkosCA,VerkadeP,etal.Tightjunctionsaremembranemicrodomains[J].JCellSci,2000,113(10):1771-1781.

[7]JodoinJ,DemeuleM,FenartL,etal.P-glycoproteininblood-brainbarrierendothelialcells:interactionandoligomerizationwithcaveolins[J].JNeurochem.2003,87(4):1010-1023.

[8]IkezuT,UedaH,TrappBD,etal.Affinity-purificationandcharacterizationofcaveolinsfromthebrain:differentialexpressionofcaveolin-1,-2,and-3inbrainendothelialandastroglialcelltypes[J].BrainRes.1998,804(2):177-192.

[9]ChlachetzkiF,PardridgeWM.P-glycoproteinandcaveolin-1alphainendotheliumandastrocytesofprimatebrain[J].Neuroreport.2003,14(16):2041-2046.

[10]OiverS,DuboisC,SchachnerM,etal.TheF3neuronalglycosylphosphatidylinositol-linkedmoleculeislocalizedtoglycolipid-enrichedmembranesubdomainsandinteractswithL1andFynkinaseincerebellum[J].JNeurochem,1995,65(5):2307-2317.