氢气饱和生理盐水对离体大鼠心脏LVEDP和MDA、SOD的影响

氢气饱和生理盐水对离体大鼠心脏LVEDP和MDA、SOD的影响

刘雪聪1刘福林1李志林2周晓东1申文增3

1.河北大学附属医院河北保定071000；2.河北大学化学院河北保定071000；

3.河北大学生理教研室河北保定071000

摘要：目的探讨氢气饱和生理盐水对离体大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法48只大鼠随机分为实验组（24只）和对照组（24只）。对照组采用K-R液，实验组采用K-R液+氢气饱和生理盐水。处理后取出大鼠心脏并建立Langendorff模型，并将离体的心脏按逆灌注10min，常温旷置20min、再灌注20min进行处理。检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）含量，左室舒张末期压（leftventricularend-diastolicpressure，LVEDP）值变化。结果MDA增高以对照组缺血期最显著，且对照组缺血期和缺血再灌注期与实验组同期比较差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。对照组缺血期、缺血再灌注期与缺血前期相比差异明显（P＜0.05）。实验组缺血期、缺血再灌注期与缺血前期无明显差异。SOD活性实验组较对照组增强且具有明显差异（P＜0.01）。对照组缺血再灌注期LVEDP明显增高（P＜0.05），实验组缺血再灌注期LVEDP较缺血前期无显著差异，但与对照组同期比较下降明显（P＜0.05）。结论氢气饱和生理盐水对心肌缺血再灌注损伤具有明显的保护作用。

关键词：心肌缺血再灌注损伤；氢气饱和生理盐水；MDA；SOD

Abstract：ObjectiveToexploretheprotectiveeffectsofhydrogensaturatedsalineininducedmyocardialischemiareperfusioninjuryinrats.MethodsForty-eightratswerepidedrandomlyintotheexperimentalgroup（24）andthecontrolgroup（24）.TheratsofexperimentalgroupweretreatedwithK-Rsolutioncombinedwithhydrogensaturatedsaline，thecontrolsweregivenK-Rsolutiononly.Afterthetreatment，theheartswereexcisedratsandLangendorffmodel.Andtheheartoftheinvitrobyinverseperfusionfor10minutes，normaltemperatureplacefor20minutes，20minutesofreperfusion.Thesolutionofthecardiacmuscletissueoftheratsweretreatedwithsalineandthentheaccountsofmalondialdehyde（MDA）andtheactivityofsuperoxidedismutase（SOD），andthechangesofleftventricularend-diastolicpressure（LVEDP）weredeterminedtocomparethedifferentprotectiveeffects.ResultsTheaccountsofMDAinthecontrolgroupwerethehighest，therewasasignificantdifferencebetweentheexperimentalgroupandthecontrolsconcerningwiththeresultsofischemiaperiodandreperfusionperiod（P<0.01，P<0.05）.Thereweredifferencesamongtheischemiaperiodandreperfusionperiodandpreischemiaperiodinthecontrolgroup（P<0.05）.Intheexperimentalgroup，therewasnotsignificantdifferenceamongtheischemiaperiodandreperfusionperiodandthepreischemiaperiod.TherewasasignificantdifferencebetweentheexperimentalgroupandthecontrolsconsideringtheactivityofSOD（P<0.01）.TheaccountsofLVEDPofthecontrolgroupwasobviouslyhigh（P<0.05）.ThelevelofLVEDPinexperimentalgroupwasobviouslylowerthaninthecontrolgroup（P<0.05），buthadnosignificantdifferencetoischemiaperiod.ConclusionHydrogenrichsalineisquiteeffectiveinalleviatingmyocardialischemiareperfusioninjury.

Keywords：myocardialischemiareperfusioninjury；hydrogen-richsaline；MDA；SOD

在体外循环下心脏直视手术时，心脏会经历缺血再灌注的过程，缺血再灌注损伤会引起如心肌顿抑，心律失常等[1]。目前，缺血再灌注损伤发生的机制尚未完全阐明，研究表明，自由基、钙超载、心肌纤维能量代谢障碍、细胞凋亡等均可参与缺血再灌注损伤。然而，尚未有临床证实哪种措施可通过减少氧活化来有效预防心肌早期再灌注损伤[2]。研究表明，氢气可有效地中和羟自由基及过氧亚硝基等阴离子[3]。近年来文献报道，氢气可作为抗氧剂用于脑缺血所致的再灌注损伤[4]。因此，本研究通过比较常规灌注液与加入氢气的灌注液所致心肌损伤程度不同，观察心肌组织丙二醛（MDA）的含量，超氧化物歧化酶（SOD）的活性以及左室舒张末压（LVEDP）变化。

1材料和方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物

Wistar大鼠48只，雌雄不限，体质量200～350g，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所动物实验中心提供，合格证号：SCXK-（军）2009-003。

1.1.2主要试剂

氢气制备：由河北大学化学院李志林老师提供，该技术已获得国家专利，专利名称为一种钙镁富氢水添加剂及其制备方法，专利号ZL102557227B。

SOD、MDA检测试剂盒和考马斯亮蓝蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.1.3实验仪器

超级恒温浴，重庆试验设备厂；BL-420生物技能实验系统，成都泰盟电子有限公司；天平、组织研磨器，涿州长虹玻璃仪器厂；721型分光光度计，四川分析仪器厂。

1.2实验分组及模型制备

1.2.1动物分组

取wistar大鼠48只，对其进行摘取心脏处理后，建立Langendorff模型，并将离体的心脏按逆灌注10min，常温旷置20min、再灌注20min进行处理。分为对照组与实验组，每组24只；其中对照组采用K-R液，实验组采用K-R液+氢气饱和生理盐水（5mL/kg，pH7.3），两组灌注压力7.85kPa。上述两组分别分成缺血前期、缺血期和再灌注期，每8只大鼠1组，共6组。

1.2.2Langendorff模型制备

（1）麻醉与抗凝：采用腹腔注射方式，按大鼠体积注射戊巴比妥钠（30mg/kg）、肝素（250U/kg）。（2）取材：待麻醉起效后，迅速从沿剑突下肋缘剪开腹壁并打开膈肌，同时，将两侧腋前线剪开胸壁并将其上翻至头侧，在不影响心脏主动脉的情况下，摘取心脏，立即放入4℃冰盐水中，并轻压心脏，洗去血迹。（3）心脏灌注：行主动脉插管并将其固定于Langendorff装置，将预先用氧平衡的37℃灌注液以7.85kPa灌注压进行心脏灌注，同时在左心耳处剪一小口，并经二尖瓣处将带有乳胶气囊的测压管插入左心室，同时连接BL-420生物技能实验系统，并将气囊内压力调至7mmHg。

1.3检测指标及方法

将两组大鼠心肌组织剪下，并经生理盐水漂洗后，采取匀浆处理。应用MDA、SOD试剂盒，721型分光光度计比色测定心肌组织MDA浓度及SOD活性。考马斯亮蓝法测定心肌组织蛋白的含量。利用BL-420生物技能实验系统分别记录两组各期LVEDP的变化。

1.4统计学方法

计量数据均以（±s）表示，SPSS19.0软件进行t检验及方差分析，标准水准α=0.05。

2结果

2.1MDA、SOD变化

MDA增高以对照组缺血期最为明显（P＜0.01），对照组缺血期及缺血再灌注期与实验组同期比较差异显著（P＜0.01；P＜0.05）。对照组缺血期及缺血再灌注期与缺血前期相比差异明显（P＜0.05）。对照组缺血期及缺血再灌注期MDA较实验组同期增高明显（P＜0.01；P＜0.05），实验组各期MDA比较无明显变化。对照组SOD活性缺血期与缺血前期比较无明显变化，缺血再灌注期与缺血期，缺血前期比较下降明显（P＜0.05）。与对照组同期比较，实验组缺血期与缺血再灌注期较对照组SOD活性明显增强（P＜0.01）。见表1、表2。

2.2LVEDP的变化

两组在缺血前期LVEDP无明显差异。对照组缺血再灌注期LVEDP较缺血前期明显增高（P＜0.05），实验组缺血再灌注期LVEDP较缺血前期无显著差异，但与对照组同期比较下降明显（P＜0.05）。见表3。

3讨论

本研究结果显示，氢气饱和生理盐水可降低心肌中MDA含量，提高SOD活性，改善缺血再灌注大鼠的心功能。此种心肌保护作用可能与之前报导的大脑损伤模型中分子氢选择性清除活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）有关[5]。

ROS是缺血再灌注心肌产生的，可以导致致死性的再灌注损伤[6-8]。羟自由基（•OH）和过氧化亚硝酸阴离子（ONOO−）通常被认为是有害自由基，与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化反应，其产物可以破坏具有重要功能的生物大分子（如DNA、蛋白质、脂类等）的结构和功能。最近，氢气被证明可以去除这两种ROS[5]。氢气分子是电中性的，而且分子量比氧气分子小，可以穿过细胞膜进入细胞核和细胞器如细胞核及线粒体中。线粒体又是产生活性氧簇的主要部位，有研究认为一些大分子进入线粒体困难[9]。而氢分子能够通过细胞膜进入胞内清除自由基，这一特性是其他抗氧化剂所不具备的[5]。本实验采用离体心脏灌注氢气饱和生理盐水，可以迅速使心肌细胞氢气浓度上升，氢气减少了ROS的产生、稳定了线粒体膜电位、维持了ATP稳定的合成、避免了DNA损伤、降低了脂质过氧化物MDA生成，从而保护了心肌。其中发挥保护作用的最根本机制可能是抑制了线粒体通透性转换孔的开放[10-11]。

心肌缺血后心功能的变化表现为静止张力随缺血时间的延长逐渐增高，再灌注时更加增高，如LVEDP增大。这种缺血心肌在恢复血液灌注后一段时间内出现可逆性收缩功能减低现象，称之为心肌顿抑。自由基爆发性生成和细胞内钙超载是心肌顿抑的主要发生机制。本实验证实了氢气减少了氧自由基的产生，促进心功能的恢复。

氧化应激是引起心肌缺血再灌注损伤的首要因素，因此，减轻氧化应激被认为是保护心肌细胞的重要措施。氢气的易扩散性可以使其和羟自由基反应产生成水[12]，所以可以清除ROS。在以前的医学应用中氢气仅限于检测抗菌治疗的效果[13]。虽然也有动物实验研究证明其他的给氢方式可以有效清除活性氧，但进入临床研究后几乎都失败了[14]。近年来，随着氢气在生物体内功能的深入研究，人们发现其在减轻心肌缺血再灌注损伤中具有明显的作用[15]。基于以上理论基础，本文通过建立离体Langendorff模型，对氢气饱和生理盐水在心肌缺血再灌注损伤中的作用做进一步研究，为找寻体外循环中所造成的的心肌缺血再灌注的保护方法，将为氢气饱和生理盐水应用到体外循环心脏直视手术的心肌保护提供实验资料。

本实验结果显示，氢气饱和生理盐水减轻心肌缺血再灌注时损伤，提高左心室舒张压及收缩压，但由于实验仍处于基础研究水平，还需进一步研究。

参考文献：

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作者简介：刘雪聪（1987—），男，河北邯郸人，在读硕士。

通信作者：刘福林（1966—），男，河北衡水人，主任医师，教授，硕士，硕士生导师，主要从事心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉粥样斑块易损性和冠心病的外科治疗等研究。

基金项目：河北省2013年医学科学研究重点课题计划项目（20130369）