当归注射液对受环磷酰胺损伤的骨髓细胞P53、Bax蛋白表达的影响

当归注射液对受环磷酰胺损伤的骨髓细胞P53、Bax蛋白表达的影响

张爱明

张爱明

(湖北医药学院附属襄阳医院儿科441000)

【摘要】目的：研究当归注射液对环磷酰胺损伤后的小鼠骨髓细胞P53、Bax蛋白表达的影响。方法：8-12周龄Balb/c小鼠24只，雌雄兼有，随机分为4组：正常对照组；实验对照组；预防组和治疗组。200mg/kg的环磷酰胺一次性腹腔注射，制模完成后骨髓细胞用免疫细胞化学法检测P53,Bax蛋白的表达。在光镜下，胞浆、胞膜出现黄色或棕黄色的为阳性细胞,高倍镜下随机计数200个细胞中阳性细胞数,算出阳性细胞率。结果：与正常对照组比较，实验对照组、预防组及治疗组的细胞P53、Bax蛋白阳性细胞率高(P<0.05)；实验对照组与预防组间无差异性(P>0.05)，与治疗组间有显著性差异(P<0.05)。结论：当归注射液在以治疗方式给予时，能抑制环磷酰胺损伤的骨髓细胞P53、Bax蛋白的表达。

【关键词】环磷酰胺当归注射液骨髓细胞

【中图分类号】R965【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）15-0117-01

环磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）是临床最常用的氮芥类烷化剂，是一线抗癌药物[1]。但在化疗过程中常因顾虑其对骨髓的损伤而限制用量，从而影响疗效。因此在化疗过程中，如何保护骨髓细胞不受或少受损害显得非常重要，也是临床亟待解决的一大难题。

当归是常用中药，有补血活血、润肠调经之功效。当归注射液是当归的水提醇沉制剂,因其起效较迅速,临床应用也非常广泛。前期实验已表明当归注射液能有效降低由环磷酰胺所损伤的小鼠骨髓细胞的凋亡率，且大剂量效果更明显[2]。本实验进一步测定受环磷酰胺损伤的小鼠骨髓细胞的凋亡蛋白的表达，观察使用当归注射液对它的影响，来探讨当归注射液在环磷酰胺所致的骨髓细胞损伤中的保护作用。

1.材料与方法

1.1实验动物普通级BALB/c小鼠,8－12周龄,(20±2)g,雌雄兼有。由武汉大学动物实验中心提供；常规饲养，饮水不限。

1.2主要药物和试剂当归注射液,武汉大学中南医院药剂科生产,批号:060720,每毫升含当归生药0.25g。环磷酰胺,江苏恒瑞药业公司生产,批号:06021821,0.2g/支。P53,Bax多克隆抗体,购自福建迈新试剂公司。

1.3骨髓损伤小鼠模型的建立环磷酰胺一次性腹腔注射，剂量为200mg/kg（参考高凡[3]等方法及预实验通过计数骨髓细胞数<1.0×106而确定）。

1.4分组与处理随机区组实验设计法将BALB/c小鼠24只，分为4组：①正常对照组：未注射CTX，仅腹腔注射无菌生理盐水20ml/(kg.d)，1次/日。②实验对照组：注射CTX前和后各7d内注射生理盐水20ml/(kg.d)，1次/日。③预防组:从注射CTX之前7d开始腹腔注射当归注射液2.5g/(kg.d)，1次/日。④治疗组：注射CTX后7d内腹腔注射当归注射液2.5g/(kg.d)，1次/日。各组时间均为2周，未提及的时间段用生理盐水注射，剂量为20ml/(kg.d)。2周后断颈处死,取右侧股骨,用PBS冲出骨髓细胞,1000r/min离心8min,弃上清,沉淀物以PBS重悬。

1.5P53,Bax蛋白检测按成套P53、Bax蛋白免疫组化及染色试剂盒(福建迈新公司)说明书操作。光镜下观察胞浆、胞膜出现黄色或棕黄色的为阳性细胞,在高倍镜视野下随机观察200个细胞并数出其中阳性细胞个数,算出阳性细胞率。

1.6统计学处理实验数据用均数±标准差(x-±s)表示,多组间比较采用方差分析,组间比较采用q检验。以P<0.05为有统计学意义标准。

2.结果

P53,Bax蛋白阳性表达的细胞胞膜或胞浆里可出现明显的黄色或棕黄色，在一个高倍视野（×400）下的细胞数组间存在明显差异。在显微镜高倍视野下随机观察200个细胞并数出其中阳性细胞的个数,算出阳性细胞率（见表1和表2）。

以下2表显示：正常对照组的P53、Bax蛋白的阳性细胞率较实验对照组、预防组及治疗组都明显小，各组间差异均有统计学意义(P<0.05)；当归注射液作为预防药物时，与实验对照组的P53、Bax蛋白的阳性细胞率无差异性(P>0.05)；而当归注射液作为治疗药物时，P53、Bax蛋白的阳性细胞率与实验对照组间有显著性差异(P<0.05)。

表1应用当归注射液预防时对骨髓细胞P53,Bax蛋白表达的影响

Tab.1AngelicasinensisprotectstheexpressofP53、Baxproteinonbonemarrowcellswhenitwasusedinpreventionpattern

GroupMice

numberTherateof

P53positivecells(%)Therateof

Baxpositivecells(%)

Normalgroup64.5±0.58.4±0.6

Controlgroup649.9±4.841.9±5.1

preventiongroup649.7±3.9*41.4±5.2*

*p>0.05vsthecontrolgroup

表2应用当归注射液治疗时对骨髓细胞P53,Bax蛋白表达的影响

Tab.2AngelicasinensisprotectstheexpressofP53、Baxproteinonbonemarrowcellswhenitwasusedintreatmentpattern

GroupMice

numberTherateof

P53positivecells(%)Therateof

Baxpositivecells(%)

Normalgroup64.5±0.58.4±0.6

Controlgroup649.9±4.841.9±5.1

treatmentgroup636.3±5.6*30.8±4.2*

*p<0.01,vsthecontrolgroup

3.讨论

恶性肿瘤是危害人们生命健康的常见病，化疗是其主要的治疗手段。CTX是临床一线抗癌药物，在攻击肿瘤细胞的同时也会对机体其他正常细胞的DNA产生损伤，尤其像骨髓细胞这样增殖代谢旺盛的细胞。

CTX是周期非特异性化疗药物，对增殖各期细胞均有破坏作用，可导致染色体畸变、突变而影响分裂；也可导致组织中的超氧自由基浓度迅速升高，造成DNA损伤而抑制细胞增殖，影响对细胞增殖、凋亡有重要调节作用的酶,加重细胞增殖的抑制[4]。线粒体是脂质过氧化易发部位，在细胞凋亡的级联反应中也起到关键作用[5]。CTX的致突变机制使正常细胞的DNA发生烷化，导致染色体断裂，同时增加P53基因突变，突变型P53基因表达升高。细胞内突变的P53蛋白水平增高，从而诱导下游信号Bcl-2基因家族促凋亡基因Bax表达增强，Bax转移至线粒体膜上，诱导线粒体释放出促凋亡蛋白，诱导细胞发生凋亡[6]。

实验表明：注射过大剂量环磷酰胺的小鼠，其骨髓细胞的P53、Bax蛋白的表达增高；在注射环磷酰胺前利用当归注射液进行预防，并未发现P53、Bax蛋白的表达明显改变；而利用当归注射液进行治疗时发现P53、Bax蛋白表达有明显的降低，同时骨髓细胞的计数明显增多。这可能与当归注射液的下述功能有关：①当归能保护机体免受由环磷酰胺所诱导的突变,对细胞的再生和染色体的修复有促进作用；②当归具有清除氧自由基的作用，它能通过直接消除自由基、抑制超氧自由基引起的膜脂质过氧化反应和自由基反应以及与生物膜磷脂结合而保护膜脂质等多种机理拮抗自由基对组织的损害[7]；③当归可通过直接和间接途径激活造血微环境中巨噬细胞、淋巴细胞等，也可刺激肌组织，促进其产生造血调控因子,进而促进多能造血干细胞和CFU－GM增殖分化，刺激骨髓粒单系造血。当归注射液能通过抑制骨髓细胞的凋亡来保护环磷酰胺所致的骨髓损伤，是否存在更多的保护机制需进一步研究。

参考文献

[1]刘新春.实用抗肿瘤药物治疗学[M].第一版.北京：人民卫生出版社,2002,1078.

[2]张爱明，徐之良.当归注射液对环磷酰胺损伤的骨髓细胞调亡率的影响[J].中国小儿血液与肿瘤.2007，12（2）：49－52

[3]高凡，钱嘉林，刘长喜,等.环磷酰胺对小鼠免疫抑制的动物模型建立[J].环境与职业医学，2004，21（4）：314－318

[4]RileyEH,LaneJM,UristMR,elal.Bonemorphogenticprotein-2:biologyandapplications[J].ClinOrthop,1996,32（4）：39-46

[5]BeckmanKB.Thefreeradicaltheoryofagingmatures[J].PhysiolRev,1998,78:547－550

[6]SchulerM,GreenDR.Mechanismsofp53-dependentapoptosis[J].BiochemSocTrans,2001,29(6):684-688

[7]马清均,王淑玲.常用中药现代研究与临床[M].天津：天津科技翻译出版公司,1995,622.