促红素对脑缺血再灌注炎症损伤的抑制作用研究

促红素对脑缺血再灌注炎症损伤的抑制作用研究

赵德福1宁显忠1王阿楠2

赵德福1宁显忠1王阿楠2

（1.辽宁医学院附属第三医院神经内科辽宁锦州121000；2.辽宁医学院附属第三医院重症监护病房辽宁锦州121000）

【摘要】目的：观察促红细胞生成素在局灶性脑缺血再灌注模型大鼠中对核因子-kB、环氧化酶2表达的影响，探讨EPO对大鼠脑缺血再灌注后炎症反应的抑制作用。方法：SD大鼠随机分为假手术组（SH）、模型/缺血再灌注组（IR）、EPO处理组（EPO）、二硫代氨基甲酸吡咯烷（PDTC）处理组（PDTC）和PDTC+EPO组（PDTC+EPO）。相应处理后，各组行神经功能缺损评分，标本用于免疫组织化学和WesternBlot分析海马组织NF-κB、COX-2的表达。结果：与IR组相比，其余各处理组大鼠神经功能缺损评分均明显下降（P<0.01），NF-κB及COX-2表达均明显减少（P<0.01），PDTC组COX-2的表达仍较SH组偏高（P<0.01）；与PDTC组比较，EPO组和PDTC+EPO组大鼠神经功能缺损评分均明显下降（P<0.01），COX-2的表达明显减少（P<0.01）；而EPO组和PDTC+EPO组之间大鼠神经功能缺损评分及COX-2的表达差异无统计学意义（P>0.05）。结论：EPO通过两条途径降低缺血侧海马COX-2蛋白表达减轻脑缺血再灌注大鼠海马缺血区的炎症反应，从而发挥其神经保护功能。

【关键词】促红细胞生成素；脑缺血再灌注；核因子-κB；环氧化酶2

【中图分类号】R543【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）01-0111-03

Stutyontheinhibitionoferythropoietintoinflammationoffocalcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats

ZhaoDefu1NingXianzhong1WangAnan2

（1.DepartmentofNeurology,ThirdAffiliatedHospital,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000）

（2.ICUofNeurology,ThirdAffiliatedHospital,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121000）

【Abstract】Objective：ToinvestigatetheinfluenceofEPOontheexpressionofNF-κB,cox-2withfocalcerebralischemia-reperfusion;ToexploretheinhibitionofEPOtoinflammationwithfocalcerebralischemia-reperfusioninjuryinrats.Methods：SDratswererandomlypidedinto5groups:SH,IR,PTDC,EPO,PDTC+EPOgroup.RatsmadeintothemodalwereObservedtheneurologicalscores.ThebraintissuesofratswereobservedbyimmunohistochemicalstainingandWesternBlot.Results：ContrasttotheIRgroup,thescoresoftheotherratsweredecreased(P<0.01);theexpressionofNF-κBandcox-2weredecreasedobviously(P<0.01).Theexpressionofcox-2inPDTCgroupwashigherthanSHgroup(P<0.01).ContrasttothePDTCgroup,thescoresinEPOandPDTC+EPOgroupweredecreased(P<0.01);theexpressionofcox-2weredecreasedobviously(P<0.01).TherewasnostatisticalsignificanceintheneurologicalscoresandproteinexpressionbetweenEPOandPDTC+EPOgroup(P>0.05).Conclusions：EPOcansignificantlyreducethetheexpressionsofCOX-2bytwopathwaysinratswithfocalcerebralischemia/reperfusioninjuryinordertoplayaneuroprotectiveaction.

【Keywords】erythropoietin;cerebralischemia-reperfusion;NF-κB;cox-2

缺血性脑血管病的一个重要病理生理过程是缺血再灌注损伤，炎症反应在缺血再灌注损伤中所起的作用一直备受关注[1]。Aron等人研究证明，抑制缺血再灌注后炎症反应可以保护脑神经功能。环氧合酶2(Cyclooxygenase，COX-2)作为脑缺血后基因异常表达的产物，是产生自由基和炎症介质的关键酶，参与了缺血后脑损伤的发生、发展过程，并与脑缺血的预后关系密切。COX-2的表达上调过程主要是由核因子-kB（nuclearfactorkappaB,NF-κB）调控的[2]。NF-κB是参与脑继发性炎症反应的一个重要信号转导分子，参与多种基因的表达调控，其中对COX-2基因编码的调控是NF-κB的主要功能之一。NF-κB的特异性抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷（pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC）可以抑制其活性，从而抑制COX-2的表达[3]。COX-2的表达除了受NF-κB途径调控以外是否还有其它途径目前还不十分清楚。

促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）在临床上一直被广泛用于各种贫血的治疗。近年来的研究发现，它还是一种中枢神经系统内源性细胞因子，可以起到调节脑的发生发育及神经保护的作用[4]。但EPO对脑缺血再灌注后炎症损伤的作用及其具体机制目前尚不十分清楚。本研究选择脑缺血再灌注模型大鼠为研究对象，探讨COX-2在脑缺血再灌注后炎症损伤中的作用及其表达途径，着重讨论EPO对此炎症反应过程是否存在抑制作用，为临床防治缺血性脑血管病提供理论依据。

1仪器与材料

1.1仪器

160x连续变倍体式显微镜（桂林仪器厂）；DY89-型电动玻璃匀浆机（宁波新芝科技研究所）；CIAS-1000图像分析仪（北京大恒图像视觉有限公司）；S-3800全自动免疫组化仪（美国Dakocyomstion公司）；TGLL-18G台式高速冷冻离心机（太仓市医疗机械厂）。

1.2试药

注射用重组人EPO（成都地奥九泓制药厂）；NF-κBP65一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、COX-2一抗（武汉博士德生物工程有限公司）、辣根过氧化物酶（HPR）标记的羊抗兔二抗（均由北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3动物

健康SD大鼠70只，♂，体重250～300g，由辽宁医学院实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2003-2007。

2方法

2.1分组及给药

70只健康SD大鼠，实验前动物处于同一环境（室温22℃～25℃，避免强光及噪音刺激，足够的食物和饮水）饲养7d以上，按照随机数字表法分为5组（n=14）：假手术组（SH组）、缺血再灌注组/模型组（IR组）、EPO处理组（EPO组）、PDTC处理组（PDTC组）和EPO+PDTC组。其中，EPO组于缺血2h后即再灌注同时给予腹腔注射EPO（参照文献选择有效剂量3000U/kg[5]，用生理盐水溶解，浓度为200U/mL），PDTC组于缺血2h后给予腹腔注射PDTC（参照文献选择有效剂量100mg/Kg[6]，将1000mgPDTC粉剂融化于100ml的生理盐水中，浓度为10mg/ml），（PDTC+EPO）组给药方法同EPO和PDTC组，SH组只做手术操作，不做缺血再灌注处理，于假手术2h后腹腔注射与EPO组等量的生理盐水（15ml/Kg），IR组于缺血2h后给予腹腔注射生理盐水（15ml/Kg）。

2.2模型的制备

采用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞模型。水合氯醛(3mL?kg-1)麻醉大鼠，分离左侧颈总动脉，结扎其近心端，然后在颈总动脉上剪一个小口(约为动脉直径的1/2)，将充满肝素的动脉插管插入小口，用手术线结扎固定插管后，将长6cm的鱼线插入动脉插管直至大脑中动脉，脑缺血开始后将动脉插管拔出，把鱼线和颈总动脉结扎在一起；2h后拔出鱼线，缺血再灌注开始，以大鼠神经功能学评分1～3分为模型建立成功的标志。

2.3神经功能学评分

参照Zealonga的5分制法于缺血2h后进行评分，具体标准如下，0分：无神经损伤体征；1分：不能充分伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾斜；4分：不能自主行走，意识丧失。其中1～3分为大脑中动脉阻塞模型建模成功，即脑缺血模型建模成功的标准。各组大鼠缺血2h后进行评分。

2.4标本制取和检测方法

2.4.1免疫组化法检测海马区NF-κB和cox-2的表达每组取大鼠7只，乌拉坦麻醉(5ml/kg)，灌流固定脑组织，断头取海马组织，将标本置于4%多聚甲醛液中固定，制成厚度为5μm的病理切片。取上述切片常规脱蜡，蒸馏水洗涤，3%过氧化氢溶液处理30min，以去除内源性过氧化物酶，0.01mol/LPBS洗涤3次，每次5min，分别滴加适当稀释的兔抗大鼠NF-κB一抗或兔抗大鼠cox-2一抗，4℃孵育过夜，0.01mol/LPBS洗涤3次，每次5min，滴加辣根酶标记羊抗兔多聚体(PV6001)，37℃孵育30min，0.01mol/LPBS洗涤3次，每次5min，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察海马组织中NF-κB和cox-2的表达情况。

2.4.2WesternBlot分析海马组织NF-κB和cox-2的表达取每组剩余7只大鼠，麻醉方法同上，取其海马组织迅速置于-80℃冰箱中冻存备用。(1)制备蛋白样品；(2)测定上清液蛋白含量；(3)十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳；(4)采用正电荷尼龙膜（PVDF）转移；(5)杂交；(6)显色分析；用GENEGENIUS凝胶图像系统分析各蛋白目的条带吸光度，用目的条带与β-actin条带吸光度的比值表示目的蛋白的含量。

2.5统计学方法

应用SPSS16.0软件包进行分析，计量资料结果以±S表示，两样本均数比较采用T检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐时采用LSD检验，方差不齐时采用Dunnett’sT3检验。检验水准为α=0.05。

3结果

3.1神经功能学评分

缺血再灌注24h对所有大鼠行神经功能缺损评分，SH组神经功能正常；与SH组比较，IR组大鼠神经功能缺损评分明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与IR组比较，PDTC组、EPO组和PDTC+EPO组神经功能缺损评分均明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）；与PDTC组比较，EPO组和PDTC+EPO组神经功能缺损评分进一步降低，差异有统计学意义（P<0.01）；而EPO组和PDTC+EPO组之间比较，神经功能缺损评分差异无统计学意义（P>0.05）。（见表1）

4讨论

环氧合酶2(cyclooxygenase,cox-2)，是催化花生四烯酸生成前列腺素和血栓素的限速酶，参与脑缺血、脑外伤和神经退行性变等疾病的病理过程。COX-2的启动子序列中含有NF-κB特异结合序列，即COX-2是NF-κB的下游靶基因之一。NF-κB以无活性的形式存在于细胞浆中，不具有调节基因转录功能[7]。在缺血缺氧条件下，NF-κB就会被激活，快速易位进入胞核内，启动靶基因转录，将信息从胞浆传至胞核，进而参与炎症反应、自由基损伤等病理生理过程[8]，加重缺血再灌注损伤。本研究显示，大鼠脑缺血再灌注后，神经细胞NF-κB及COX-2表达比假手术组明显增多，大鼠神经功能缺损明显。给予NF-κB抑制剂PDTC后，细胞内COX-2表达明显减少，此结果表明，COX-2在脑缺血再灌注后炎症反应的过程中起到重要作用。而且，NF-κB对COX-2的调控是COX-2表达的重要途径之一。但值得注意的是，PDTC组COX-2的表达量虽然较IR组降低，但较SH组仍较高，这表明COX-2的调控除了NF-κB途径之外还有非NF-κB途径。

EPO是一种糖蛋白，主要用于治疗贫血，目前发现在正常人脑组织和缺血脑组织中均有EPO及其受体的表达[9]。体外实验发现，EPO对缺氧处理过的培养神经细胞可产生明显的保护作用[10]。但EPO对脑缺血再灌注后炎症反应的作用和机制目前不十分清楚。本研究中，PDTC+EPO组中加入了NF-κB的抑制剂PDTC，NF-κB的表达受到抑制，EPO组未加PDTC，而结果显示COX-2的表达量在EPO组和PDTC+EPO组无差异，因此我们推断，EPO可以对COX-2表达的NF-κB途径产生抑制作用。PDTC+EPO与PDTC两组均加入了PDTC，两组内COX-2表达的NF-κB途径都被抑制了，但在PDTC+EPO组COX-2的表达量比单纯PDTC组进一步降低，表明在PDTC+EPO组，诱导COX-2表达的非NF-κB途径被EPO抑制了。因此，我们得出，EPO对COX-2表达的NF-κB途径和非NF-κB途径均可以起到抑制作用。

综上所述，通过本研究，表明EPO可以通过NF-κB途径和非NF-κB途径抑制COX-2的表达，从而发挥其神经保护作用。但是EPO发挥作用的详细机制，如抑制COX-2表达的具体分子靶点目前还不十分清楚，还需进一步研究。

参考文献：

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[5]LiY,LuZY,KeoghCL,etal.Erythropoietin-inducedneurovascularprotection,angiogenesis,andcerebralbloodflowrestorationafterfocalischemiainmice.JCerebBloodFlowMetab,2007,27(5):1043-1054.

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[9]HellewellSC,YanEB,AlwisDS,etal.Erythropoietinimprovesmotorandcognitivedeficit,axonalpathology,andneuroinflammationinacombinedmodelofdiffusetraumaticbraininjuryandhypoxia,inassociationwithupregulationoftheerythropoietinreceptor.JNeuroinflammation.2013,18;10:156.

[10]LiuX,WuH.Progressonneuroprotectiveeffectsoferythropoietin.ZhejiangDaXueXueBaoYiXueBan.2013,42(6):693-9.

作者简介：

赵德福，男，医学硕士，通信地址：辽宁省锦州市凌河区和平路五段2号。

通讯作者：

宁显忠，教授，主任医师，辽宁医学院附属第三医院神经内科，研究方向为脑血管病的诊断与治疗。