骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化

曾维柯志勇陈茂祯

（广东省湛江吴川市人民医院骨科二区广东湛江524500）

【摘要】目的：为了探讨来源于骨质疏松病人的干细胞的成骨分化，选择临床上被诊断为骨质疏松的病人，对其骨髓干细胞进行诱导分化。方法：使用梯度离心，从临床上的8名病人（骨质疏松患者A组和非骨质疏松患者B组各4例）腰椎的骨髓血液分离出病人的骨髓间的充质干细胞，在体外扩增三至四倍后进行试验。一般成骨的诱导液中，含有地塞米松（DXM）（100nmol/L），β-甘油磷酸钠（sodiumβ-glycerophosphate）（10mmol/L）、二磷酸抗坏血酸（TPAsA）（0.05mmol/L）溶解在含100mL/L胎牛血清的含较低糖分的DMEM中。测定hMSC的增加值以及碱性的磷酸酶（ALP）的量来反应病人的干细胞成骨的分化情况。使用定量PCR检测病人的Runx-2、ALP、osteocalcin（OC）和osteonectin（ON）的水平；通过茜素红进行染色，以确认病人的钙离子浓度。结果：对比发现，两组病人的干细胞的增值存在显著性的差异，A组病人相对于B组病人，其降低幅度更大，但ALP的含量没有显著性差异的存在。Q-PCR的检测结果显示，在第三、七天时，A组的Runx-2以及ALP的mRNA表达均要显著低于B组；染色以及钙离子定量分析显示，同B组相比，A组的染色较浅，并且钙离子的浓度更低。结论：临床上采用成骨来诱导病人的干细胞进行分化（DXM、sodiumβ-glycerophosphate、TPAsA），结果表明：骨质疏松病人的干细胞的成骨分化的能力要显著低于非骨质疏松病人。因而，临床上选取骨质疏松病人本身的充质干细胞来作为治疗的种子，可能并不适用。

【关键词】骨质疏松；成骨分化；充质干细胞；临床分析

【中图分类号】R580【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）02-0219-01

【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheosteogenicdifferentiationofstemcellsfrompatientswithosteoporosis,andchoosetheclinicaldiagnosisofosteoporosis,andinducethedifferentiationofbonemarrowstemcells..Methodsusinggradientcentrifugation,fromclinicaleightpatients(osteoporosispatientsingroupAandnonboneosteoporosispatientsinBgroup,4casesoflumbarbonemarrowbloodwereisolatedfromapatient'sbonemarrowmesenchymalstemcells,invitroamplificationofthreetofourtimesafterthetest.Resultsoftwogroupsofpatientswithstemcellproliferationsignificantlydifferencesexist,patientsingroupAwithrespecttothepatientsingroupB,whichreducesthemagnitudeoflarger,buttheALPcontentwithouttheexistenceofsignificantdifferenceswerefound.DetectionofQ-PCR.

【Keywords】osteoporosis,osteogenicdifferentiation,bonemarrowmesenchymalstemcells,clinicalanalysis

随着全球老龄化的不断加剧，患骨质疏松的病人越来越多，其还具有易发作，并且具有多发性[1]。人体骨髓的充质干细胞（（humanmarrow－derivedmesenchymalstemcells，hMSC）能够在体外被诱导成病人的成骨，软骨甚至是脂肪的分化。这对于病人的骨愈合以及再生等均具有非常重要的临床研究意义[4]。近些年以来，随着干细胞的不断发展，其诱导分化很可能有助于该类疾病的治疗。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究经患者本人以及家属的同意，选取2015年2月份~2015年5月份于本院实施外脊柱手术的55岁以上的绝经女性为研究对象，按临床上对于骨质疏松症的诊断标准，将病人分为骨质疏松组即A组四人，非骨质疏松组即B组四人。病人的年纪均在55~75岁之间，A组病人平均年纪为（60±6.8）岁，B组平均年纪（61±7.1）岁。两组病人之间临床一般资料对比，无显著性差异。

1.2方法与评价

将两组病人的hMSC扩增至P4代，接种至96孔板上，接种密度为1.34×104/cm2，进行培养。成骨的诱导液中含有DXM、sodiumβ-glycerophosphate（β-GP）、TPAsA的10%的FBSL-DMEM培养基。为了探究成骨诱导的各种成分对于hMSC的增殖以及分化的关联性，将实验分为DXM、β-GP和TPAsA以及DEM+TPAsA、DXM+β-GP和β-GP+TPAsA，空白对照组加入10%的FBSL-DMEM培养液。96空白进行增殖、钙量测定以及磷酸酶量测定，6孔板用来提取总RNA以及相关的基因进行定量检测[5]。

96孔板的hMSC分别在成骨诱导的第三、七、十四天进行增殖活性的检测，使用酶联免疫仪器，在450nm处测定各个孔的吸光度（D），测定细胞的活性。检测完成后，使用PBS清洗两遍，加入ALP缓冲溶液，100μL/孔，37℃下孵育10min。再加入PNPP100μL/孔，37℃下孵育15min；2mol/L的NaOH100μL/孔，室温下避光10min反应；于405nm处记录测得OD值。

1.3统计学分析

使用统计学软件（SPSS20.0）对细胞的增值以及ALP的含量实施统计学分析。基因以及钙量对比则采用t检验，数据用x±s来表示，P＜0.05则表示具有显著的统计学差异。

2结果

2.1干细胞的活性

图1A（A组）和1B（B组）中各个试验的处理因素在第三、七、十四天时的细胞增殖显示：A组和B组均随着时间在不断增殖，但其具有显著的统计学差异（F=54.667，P＜0.001）；并且组间也具有显著性的差异（F=16.727，P＜0.001）。来源于A组的细胞的增殖，其活性要显著低于B组。

图1A组与B组的hMSC成骨诱导的细胞增殖的活性对比

图2A组与B组的hMSC细胞磷酸酶（ALP）的活力检测对比

2.2干细胞的成骨分化的基因检测

在第三、七天时，A组的Runx-2以及ALP的mRNA水平均要显著的低于B组，至第十四天时两组间没有显著的统计学差异，如图3。A组的OC基因在第三、七、十四天时，mRNA的表达要显著的低于B组，而ON仅仅在第七天时存在显著性的统计学差异。

图3q－PCR检测以及hMSC诱导的成骨分化的关键因子Runx－2以及ALP、osteocalcin（OC）、osteonectin（ON）的表达检测

3讨论

多向的分化是充质干细胞的一个非常重要的生物学特性，这也是研究干细胞的价值所在。临床上，已经有医生使用干细胞对关节软骨进行修复治疗。本实验为了探讨来源于骨质疏松病人的干细胞的成骨分化，选择临床上被诊断为骨质疏松的病人，对其骨髓干细胞进行诱导分化[6]。使用梯度离心，从临床上的8名病人腰椎的骨髓血液分离出病人的骨髓间的充质干细胞，在体外扩增三至四倍后进行试验。

综上所述，临床上采用成骨来诱导病人的干细胞进行分化（DXM、sodiumβ-glycerophosphate、TPAsA），结果表明：骨质疏松病人的干细胞的成骨分化的能力要显著低于非骨质疏松病人。因而，临床上选取骨质疏松病人本身的充质干细胞来作为治疗的种子，可能并不适用。

参考文献：

[1]蔡维望,王世立.间充质干细胞的成骨分化及对骨质疏松的影响[J].中国生物工程杂志,2012,32(4):89-95.

[2]范龙坤,陈勇,华泽权.微小RNA调控骨髓干细胞,成骨破骨细胞在骨代谢中的影响[J].中国组织工程研究,2012,16(32):6047-6052.

[3]童天朗,高悠水,蒋雷生.人骨髓间质干细胞成骨向脂肪转分化的研究[J].同济大学学报(医学版),2013,2:010.

[4]史跃,尹文洲,陈启忠,等.自体骨髓间充质干细胞动脉灌注联合局部注射治疗股骨头坏死[J].中国组织工程研究,2011,15(6):1065-1069.

[5]代学俊,岑蔼儿,张春梅,等.骨质疏松症抑制人间充质干细胞的成骨分化[J].中山大学学报(医学科学版),2014,5:013.

[6]蒋建发,孙爱军.中老年女性骨质疏松症的防治——中老年女性骨质疏松症流行病学现状,分类及诊断[J].中国实用妇科与产科杂志,2014,30(5):323-326.