一种新的HIV-1潜伏感染模型的建立方法

一种新的HIV-1潜伏感染模型的建立方法

李亮助李琳

李亮助李琳（通讯作者）（上海市公共卫生临床中心上海201508）

【摘要】本研究在原有工作基础上进一步优化HIV-1潜伏感染细胞模型的建立方法。利用表达绿色荧光蛋白（GreenFluorescentProtein，EGFP）的HIV-1假病毒感染人JurkatT细胞，采用流式细胞术分选出GFP阳性细胞群，经20天培养后，获得静息的GFP阴性的细胞群，之后通过激活剂曲古抑菌素A（TrichostatinA，TSA）刺激，检测GFP以及p24抗原的表达情况，筛选出HIV-1潜伏感染的单克隆细胞群。该新方法较传统方法更为有效，所建立的HIV-1潜伏感染模型可用于各种药物或激活剂的筛选和检测，也为进一步研究HIV-1潜伏感染机制奠定了工作基础。

【关键词】HIV-1JurkatT细胞系绿色荧光蛋白潜伏感染模型

【中图分类号】R392-33【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）03-0041-02

人免疫缺陷病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV）-1感染所导致的获得性免疫缺陷综合症（acquiredimmunodeficiencysyndrome，AIDS)自1981年被发现以来，一直严重威胁着全人类的生存和健康。而目前除了高效抗逆转录病毒疗法（highlyactiveantiretroviraltherapy，HAART）能够明显减缓疾病进程外，尚无其他更为有效的替代治疗方案。但是此仅有的HAART治疗方案依然不能从根本上治愈HIV感染者：由于HIV-1感染宿主细胞后，其病毒基因组可以整合在宿主细胞基因组上形成处于静默状态的前病毒，这些静默的前病毒不会进行或仅在极低水平上进行转录和复制，因此避免了宿主免疫系统和抗逆转录病毒药物的攻击从而得以长期潜伏；一旦条件合适，潜伏的病毒又能恢复复制能力，导致HIV感染者的病情迅速恶化[1][2]。因此如何有效清除HIV-1潜伏储存库成为攻克AIDS这一难题的关键所在，需要我们对其潜伏的形成机制有清楚的了解，而建立HIV-1潜伏感染模型是研究HIV潜伏感染机制以及研究相关清除HIV潜伏感染的药物的关键环节和基础。在我们以前的研究工作中[3]，曾经采用国际上通用的HIV-1潜伏感染模型制备方法[4-6]，成功获得了HIV-1潜伏感染的单克隆细胞系；而在本研究中，我们对以前的方法进行了改进，建立了一种更为有效的HIV-1潜伏感染模型制备新方法。

1、材料与方法

1.1质粒

pNL43-GFP质粒由仇超等人构建[7]，该质粒含有编码HIV前病毒所需的全长基因序列，在nef基因读码框内引入绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因，并通过env和vpr基因5’移码突变使得Env和Vpr蛋白缺陷。疱疹性口腔炎病毒G糖蛋白（VesicularStomatitisVirusGlycoprotein，VSVG）质粒为复制缺陷型HIV-1病毒载体通用包膜质粒，由本实验室保种。

1.2细胞株

293T细胞株和Jurkat细胞株由本实验室保存，分别培养于含10%胎牛血清（FBS，Gibco），1%青链霉素的DMEM培养液（Gibco）和RPMI1640培养液（Gibco）中。

TZM-bl细胞株由美国国立卫生院（NIH）AIDSResearchandReferenceReagentProgram提供，细胞培养于含10%FBS和1%青链霉素的DMEM培养基中。

1.3假病毒的制备和滴度检测

在10cm培养皿中接种293T细胞，待细胞汇合率为70～80%时，采用Lipofectamine2000试剂（Invitrogen）共转染pNL43-GFP（15μg）和pVSVG（7.5μg）。48～72h后收集上清，3000rpm离心5min去除细胞碎片后，采用0.45μmMillex滤器（Millipore）过滤，分装后冻存于-80℃备用。用TZM-bl细胞对假病毒的滴度进行检测[8]。

1.4HIV-1潜伏感染的单克隆细胞系的制备

在6孔板里，每孔接种1×106Jurkat细胞，用105TCID50假病毒液悬浮混匀，补入15μg/mlDEAE，在25℃下1200g离心2h[9][10]。然后用1×PBS洗2遍去除残留假病毒，每孔换入2mlRPMI1640培养基（含10%FBS），于37℃、5%CO2培养48～72h后用FACS-Aria流式细胞仪（BectonDickinson）分选出GFP阳性细胞群，培养20天后用流式细胞仪分选出转为GFP阴性的细胞群，将其有限稀释到96孔板中进行单克隆扩增培养，获得单克隆细胞系。

1.5HIV-1潜伏感染的单克隆细胞系的鉴定

经扩增培养的单克隆细胞用200nM的TSA持续刺激48h，用流式细胞仪对刺激前后GFP阳性细胞的比例进行检测分析；并采用p24ELISA检测试剂盒（河北医科大学）检测刺激前后单克隆细胞培养上清中的HIV-1病毒蛋白p24的浓度。

1.6数据分析

实验数据统计分析使用Prism5软件（GraphPadsoftware,SanDiego,CA），采用平均值±标准偏差（Mean±SD）的方式进行作图。组间的统计学差异用t-检验方法进行计算，P<0.05被认为数据之间有显著的统计学差异。

2结果

2.1HIV-1潜伏感染细胞系的建立

经293T细胞包装的假病毒（pNL43-GFP+pVSVG），带有GFP基因并具备单轮感染活性[7]，感染TZM-bl细胞后鉴定病毒滴度均介于1×104～1×105TCID50/ml之间。用该表达GFP的HIV-1假病毒感染人JurkatT细胞后，通过流式细胞术分选出GFP阳性的T细胞群，即感染了HIV-1假病毒的细胞群；将这些GFP阳性的T细胞群培养20天后，部分原GFP阳性的T细胞不再表达GFP；之后用流式细胞术分选出这些转为GFP阴性的细胞群，并利用有限稀释法制备成单克隆细胞系，种于96孔板中进行培养扩增；使用TSA刺激48h，能够重新表达GFP的单细胞克隆即为HIV-1潜伏感染的单细胞克隆。（如图一所示）

图一、HIV-1潜伏感染细胞模型建立流程示意图

2.2HIV-1潜伏感染细胞系的鉴定

上述方法制备的单克隆细胞系中随机挑取6个单克隆进行鉴定（clone2B,5D,5G,12D,15E,25C），并使用未感染的JurkatT细胞作为阴性对照。

2.2.1GFP的表达

该6株单克隆细胞系在没有激活剂TSA存在下经过共约5周左右的培养及扩增后，使用流式细胞术对其GFP的表达情况进行检测，发现GFP阳性细胞比例均稳定于0～3%（图二），证实在没有激活剂存在的情况下这些细胞系不表达或者极低表达GFP。采用TSA（200nM）刺激48h后，发现6株单克隆细胞系GFP表达均显著增加（P<0.05），最弱的Clone5D激活后GFP阳性细胞比例约30%，而最强的Clone15E激活后GFP阳性细胞比例高达90%以上（图二）。

图二、TSA刺激前后单克隆细胞系中GFP的表达变化。

使用t-检验方法分析TSA刺激（+TSA）组和未用TSA刺激（-TSA）组之间的显著性差异，*：P<0.05

2.2.2p24蛋白的表达

对该6株单克隆细胞系，分别收集未刺激和TSA（200nM）刺激48后的细胞上清，进行HIV核心抗原p24的ELISA检测。如图三所示，各单克隆细胞系在TSA刺激前不表达或者极低表达p24蛋白，而在TSA刺激后p24蛋白的表达均有显著增高（P<0.05）。

图三、单克隆细胞系经TSA刺激前后的p24蛋白表达变化

使用t-检验方法分析TSA刺激（+TSA）组和未用TSA刺激（-TSA）组之间的显著性差异，*：P<0.05

3、讨论

我们以前所建立的HIV潜伏感染模型制备方法[3]是使用携带表达GFP基因的HIV-1假病毒感染人JurkatT细胞，通过流式细胞术分选出GFP阴性的T细胞群，之后用激活剂TSA对这些细胞进行刺激，如果这些GFP阴性的T细胞中整合有静默的HIV-1前病毒，那么在TSA的刺激下这些细胞就会开始表达GFP；然后再次使用流式细胞术分选出GFP阳性的细胞，并通过有限稀释法最终制备获得HIV-1潜伏感染的单克隆细胞系。

在原来的这一方法中，第一次使用流式细胞术分选得到的GFP阴性的T细胞群中其实包含了未感染的细胞以及整合有病毒基因组的HIV-1潜伏感染细胞，其中未感染的细胞占了绝大部分。为了从中找出HIV-1潜伏感染的细胞，必须对大量克隆进行筛选，工作量较大。而在本研究中，我们尝试建立了一种新的HIV-1潜伏感染克隆的筛选方法：同样用表达GFP的HIV-1假病毒感染人JurkatT细胞后，通过流式细胞术分选出GFP阳性（而不是GFP阴性）的T细胞群。将这些GFP阳性的T细胞群培养20天后，部分原GFP阳性T细胞不再表达GFP，这意味着这部分细胞中所感染的HIV-1病毒进入了静息的潜伏状态；之后用流式细胞术分选出这些转为GFP阴性的细胞群，制成单细胞克隆。后续的鉴定实验证明这些单细胞克隆中大部分都是HIV-1潜伏感染的细胞。因此与原来的传统方法相比，本研究所建立的新方法效率更高。

而另一方面，使用新方法筛选得到的HIV-1潜伏克隆在受到激活剂TSA刺激后，无论GFP还是p24的表达都高于传统方法制备的潜伏克隆[3]，这些差异可能与两种方法所建立的单克隆细胞系中HIV-1前病毒在宿主细胞染色体上整合位点的倾向性不同有关，需要在后续工作中进行进一步的验证。

总之，HIV-1潜伏感染的分子机制研究以及相应的药物研发在客观上需要获得更多的HIV潜伏细胞模型。而本研究在原来研究工作的基础上对HIV-1潜伏模型细胞的制备方法进行了进一步的优化，提高了制备效率，为进一步探讨HIV-1潜伏感染机制，进而研究HIV-1潜伏储存库的清除策略奠定了良好的细胞模型基础。

参考文献

[1]SonzaS,CroweSM.ReserviorsforHIVinfectionandtheirpersistenceinthefaceofundetectableviralload[J].AIDSPatientCareSTDs,2001,15(10):511-518.

[2]ChunTW,StuyverL,MizellSB,eta1.PresenceofaninducibleHIV-1latentreservoirduringhighlyactiveantiretroviraltherapy[J].ProcNatlAcadSciUSA,1997,94(24):13193-13197.

[3]李琳,仇超,李亮助,等。HIV-1潜伏感染人JurkatT细胞模型的建立[J]。中国艾滋病性病。2011,17（4）:387-394.

[4]YefeiHan,MeganWind-Rotolo,Hung-ChihYang,etal.ExperimentalapproachestothestudyofHIV-1latency[J].NatureReviewsMicrobiology,2007,5:95-106.

[5]AlessandraM,JillMH,andFabioR.AnInVitroSystemtoModeltheEstablishmentandReactivationofHIV-1Latency[J].TheJournalofImmunology,2008,181:77137720.

[6]AlbertJ,DwayneB,andEricV.HIVreproduciblyestablishesalatentinfectionafteracuteinfectionofTcellsinvitro[J].TheEMBOJournal,2003,22(8):1868-1877.

[7]仇超,彭虹,黄相刚,等.携带绿色荧光蛋白基因的单轮感染活性HIV假病毒的建立及其活性检测[J].中华微生物学和免疫学杂志,2006,26(5):493-893.

[8]PreparationandTitrationofHIV-1Env-Pseudoviruses.DukeCentralImmunologyLaboratory.2008.(Accessedathttp://www.hiv.lanl.gov/content/nab-referencestrains/html/Protocol-Preparation-and-Titration-of-HIV-1-Env-PseuodovirusesJuly-2008.pdf)

[9]MeganK.Liszewski,JianqingJ.Yu,UnaO’Doherty.DetectingHIV-1integrationbyrepetitive-samplingAlu-gagPCR[J].Methods,2009,47(4):254-260.

[10]UnaO’Doherty,WilliamJ.Swiggard,DeepaJeyakumar,etal.ASensitive,QuantitativeAssayforHumanImmunodeficiencyVirusType1Integration[J].JournalofVirology,2002,76(21):10942珺10950.