实验性自身免疫性肝炎小鼠脾脏CD4+T细胞上CD137的表达及其意义

实验性自身免疫性肝炎小鼠脾脏CD4+T细胞上CD137的表达及其意义

贺静邓志华李晓妮王琪

贺静邓志华李晓妮王琪

(山西医科大学第二医院消化科，太原030001)

摘要：目的建立自身免疫性肝炎小鼠模型，研究CD137在小鼠脾脏CD4+T细胞上的表达及其意义。方法采用易感动物C57BL/6小鼠，在第1天和第7天分别以新鲜制备的S-100肝抗原0.5ml与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后予腹腔注射，4周后流式细胞术检测脾脏CD4+T细胞上CD137的表达，ELISA实验检测T细胞培养上清液中IL-17的浓度。结果模型组小鼠血清中ALT、AST、球蛋白水平较对照组明显升高，白蛋白水平降低（P＜0.05），血清中可见抗核抗体，肝组织学可见汇管区和肝实质界面的炎症。流式细胞术结果显示活化前后模型组小鼠CD4+T细胞上CD137的表达均明显高于正常对照组(P＜0.05)。ELISA实验结果示活化前后模型组T细胞培养上清液中IL-17水平均显著高于对照组(P﹤0.05)。结论实验性自身免疫性肝炎小鼠脾脏CD4+T细胞上CD137高表达，且与促炎因子IL-17的产生可能有一定的关联。

关键词：自身免疫性肝炎；CD137；T细胞

自身免疫性肝炎（AIH），是一种肝脏的炎症性疾病，女性多见，患者血清氨基转移酶增高，血液循环内可检测到自身抗体，伴有高免疫球蛋白血症。肝组织学改变为：界面性肝炎，汇管区有单核细胞、淋巴细胞、浆细胞和巨噬细胞浸润，并侵及肝小叶实质，炎性细胞围绕于坏死肝细胞，最终可导致肝纤维化和肝硬化[1]。目前其病因及发病机制不明，但一般认为是多种因素引起的自身免疫反应，与多种免疫细胞有关，尤其是CD4+T细胞。研究显示多种免疫性疾病与T细胞的异常活化有关[2-3]，而CD137作为T细胞活化的第二信号分子在诱导T细胞活化、细胞因子分泌并延长其免疫应答效应中的作用逐渐受到重视，然而在AIH中T细胞上CD137表达及作用机制目前尚不明确，因此我们建立实验性自身免疫性肝炎小鼠模型，检测T细胞上CD137的表达，进一步探讨AIH的发病机制。

1材料和方法

1.1实验动物四周龄雄性C57BL/6小鼠40只，清洁级，购自北京军事医学科学院实验动物中心，许可证编号：SCXK-（军）2007-004，自由进食水。

1.2主要试剂弗氏完全佐剂（美国Sigma公司），FITC-标记羊抗小鼠IgG(H+L)（美国Earthax公司），小鼠CD3单抗、FITC-抗小鼠CD4、PE-抗小鼠CD137及相应荧光素标记的同型对照（美国eBioscience公司），小鼠脏器组织淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限责任公司），小鼠白介素-17ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.3实验性自身免疫性肝炎模型的构建

1.3.1抗原的准备：取C57BL/6小鼠脱颈处死，取出肝脏置冰上，将肝组织剪碎，生理盐水反复冲洗除去血液，与等量的生理盐水进行匀浆，匀浆后行超声粉碎，使肝细胞内蛋白质充分释出。将匀浆以2000r/min的速度离心10min以去除细胞核部分，取上清然后以超速离心机以24100r/min的速度离心1h。取上清液，其中即含肝抗原S-100。

1.3.2模型的建立：将实验动物30只随机分为对照组和模型组，每组15只。对照组于第1天和第7天腹腔分别注射0.5ml生理盐水与等量弗氏完全佐剂的充分乳化液1ml，模型组注射0.5mlS-100与等量弗氏完全佐剂的充分乳化液1ml。第4周处死小鼠，获取外周血、肝和脾组织。

1.3.3模型的鉴定：根据小鼠血清中ALT、AST、TBIL、白蛋白、球蛋白、自身免疫性抗体（SMA、ANA）及肝脏组织学形态鉴定模型。

1.4实验步骤

1.4.1淋巴细胞的分离和培养：脱颈处死小鼠，浸泡于75﹪的乙醇中3-5min，超净台中取出脾脏，在培养皿中放入4ml小鼠脏___________器组织淋巴细胞分离液，200目尼龙网放在培养皿上，脾脏置于尼龙网上用注射器活塞研磨。把悬有脾脏细胞的分离液立即转移至15ml离心管中，覆盖2ml的1640培养基。室温下，2000r/min离心15min，分离T淋巴细胞,PBS洗涤2次。用含10﹪FCS的RPMI1640培养基将T细胞调整为2×106个/ml，接种于24孔板内。接种细胞分为两组：活化组加入2μl抗CD3单抗，未活化组加入同体积RPMI1640培养基，每孔终体积为1ml。37℃、5﹪CO2、95﹪湿度条件下孵育48h后检测CD137的表达。

1.4.2流式细胞仪检测：收集细胞于离心管中，加入PE-抗小鼠CD137抗体10μl与FITC-抗小鼠CD4抗体4μl标记，室温暗处孵育15min，以FITC-IgG2b+PE-IgG做阴性对照。孵育后的细胞悬液PBS洗2次后用流式细胞仪自备软件分析CD4+T细胞中CD137阳性细胞数。

1.4.3ELISA试验检测T淋巴细胞培养上清液中IL-17浓度：具体实验步骤按所购试剂盒的说明书进行。

1.5统计学处理：数据以均数±标准差表示，根据方差齐性检验结果，两组间比较采用独立样本t检验，数据采用SPSS18.0软件进行统计学处理，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2实验结果

2.1血清生化指标：模型组小鼠AST、ALT和球蛋白水平较对照组升高，白蛋白降低（P＜0.05）。TBIL水平两组间未见明显统计学差异（P﹥0.05）。（见表1）

表1小鼠血清生化指标检测结果

分组ALT（U/L）AST(U/L)TBIL(g/L)白蛋白(g/L)球蛋白(g/L)

模型组80.70±18.74*326.76±68.80*2.56±1.12#24.47±3.18*43.06±10.18*

对照组52.60±18.98244.99±51.561.73±0.7128.16±4.8334.00±6.90

*与对照组相比，P＜0.05；#与对照组相比，P﹥0.05

2.2肝脏病理组织学变化：对照组小鼠肝脏的肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排列，肝小叶结构清晰，肝细胞间联系紧密，汇管区无炎症浸润，结构清晰可见。模型组小鼠肝脏均有病变，肝细胞肿胀，在汇管区、肝血窦内观察到不同程度淋巴细胞、浆细胞浸润，炎症细胞以淋巴细胞为主，部分严重浸润甚至破坏了肝小叶结构。

2.3自身免疫性抗体检测结果：模型组小鼠ANA阳性表达率为26.7%，未发现平滑肌抗体；对照组小鼠两种抗体均未发现。

2.4流式细胞仪结果：模型组小鼠CD4+T细胞上CD137的表达明显高于对照组（P＜0.05）；且经抗CD3单抗刺激后较对照组显著增高（P＜0.05）。（见表2）

表2小鼠脾脏CD4+T细胞上CD137的表达(x±s﹪)分组例数活化前活化后活化前后CD137差值

模型组157.38±2.29*38.51±12.36*31.94±10.15*

对照组153.41±1.2218.22±2.5611.02±1.29

*与对照组相比，P＜0.05。

2.5ELISA试验结果：模型组T细胞培养上清液中IL-17水平高于对照组（P﹤0.05），经抗CD3单抗刺激后较对照组显著增高（P﹤0.05）。（见表3）

表3T细胞培养上清液中IL-17的浓度结果(pg/ml)

分组例数活化前活化后活化前后IL-17差值

模型组159.73±1.91*48.33±19.15*38.60±17.51*

对照组153.05±2.0012.89±6.658.81±5.74

*与对照组相比，P＜0.05。

3讨论

自身免疫性肝炎动物模型的建立有多种，采用同种系小鼠S-100肝抗原与弗氏完全佐剂充分乳化后两次腹腔注射构建模型，具有简单易行，可重复性强等特点，是一种由自身反应性T细胞介导的自身免疫性肝炎小鼠模型。实验结果显示模型组血清生化指标变化与AIH结果相似、血清中有自身抗体ANA表达、肝脏组织学改变为汇管区和肝实质的界面性炎症，说明模型建立成功。

CD137（4-1BB）是近年来新发现的一个重要的共刺激分子，属于TNFR家族，表达在活化的T淋巴细胞表面，CD137和CD137L相互作用能促进T细胞增殖、活化、分泌细胞因子，如可使T细胞产生IL-2、IL-4和IFN-r等。相关研究显示AIH患者T细胞功能紊乱，其分泌的IL-2、IL-4、IFN-r等参与免疫反应，与肝功能损害密切相关[4]。本实验模型组小鼠脾脏CD4+T细胞未经CD3抗体刺激就有一定量CD137表达，说明模型组小鼠脾脏中可能存在慢性活化的T细胞，__________而这些T细胞很可能是IL-2、IL-4、IFN-r产生的来源，从而参与疾病的发生，这为探讨AIH发病机制有一定的参考价值。同时我们发现经CD3抗体刺激后模型组CD137表达较对照组显著增高，提示CD137可能在促进实验性自身免疫性肝炎T淋巴细胞的增殖、活化、分泌细胞因子中发挥着重要的作用，且疾病的发生可能与T细胞异常活化有关。

CD137信号通路可以刺激CD4+T细胞产生促炎因子IFN-r和TNF-a参与炎症，其在炎症的发生过程中起了很重要的作用[5]。除IFN-r和TNF-a外，IL-17作为一种由CD4+T细胞亚群产生的具有强大促炎效应的细胞因子在AIH的发病机制中发挥作用。本实验对小鼠脾脏T淋巴细胞培养上清液中的IL-17的浓度进行检测发现，模型组IL-17水平高于对照组，且经CD3单抗刺激后模型组IL-17浓度较对照组增高明显，其与脾脏CD4+T细胞上CD137水平变化趋势一致，所以我们推断CD137可能亦促进CD4+T细胞产生IL-17，与自身免疫性肝炎中促炎因子IL-17产生可能存在一定的关联，当然这需要进一步的研究证实，从而为AIH机制的研究提供一个新的方向。综上所述，CD137作为一种新的共刺激分子在实验性自身免疫性肝炎小鼠脾脏CD4+T细胞上高表达，导致自身反应性T细胞异常活化。通过CD137共刺激途径阻断T细胞的活化作用能减弱疾病的发生和发展，为自身免疫性肝炎发病机制和治疗的研究提供新的方向。

参考文献：

1KrawittEL.Autoimmunehepatitis[J].NEnglJMed,2006,354(1):54-66.

2张榕，罗晓光，张晓莉等.系统性红斑狼疮患者CD4+T细胞上CD137的表达[J].中国免疫学杂志,2007,23(2):167-169.

3周洁如，陈海燕，金敏等.RA患者血清和滑液中CD137的表达水平及临床意义[J].现代免疫学,2010,30(5):420-423.

4UrsChristen,EdithHintermann,ElmarJaeckel.NewAnimalModelsforAu-toimmuneHepatitis[J].Seminarsinliverdisease,2009,29(3):262-272.

5CroftM.TheroleofTNFsuperfamilymembersinT-cellfunctionanddis-eases.NatRevImmunol,2009,9:271-285.

作者简介：贺静（1985-），女，硕士研究生,山西省阳泉人。

Tel:18734895766，Email：hejing375177432@qq.com

通讯作者：邓志华，女，教授，博士生导师，Email：ykdzh@yahoo.com.cn