肌醇和肌醇六磷酸联用对裸鼠人肝癌移植瘤Bcl-2，Bax蛋白表达的影响

肌醇和肌醇六磷酸联用对裸鼠人肝癌移植瘤Bcl-2，Bax蛋白表达的影响

公伟红宋扬（通讯作者）王鹏陈沉孙立孟阳

青岛大学公共卫生学院山东青岛266021

【摘要】目的观察肌醇六磷酸（IP6）和肌醇（Ins）联用对裸鼠肝癌移植瘤的生长抑制作用以及对肿瘤组织中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法建立肝癌裸鼠人移植瘤动物模型，按移植瘤结节大小随机分为生理盐水组、IP6组、Ins组、IP6+Ins组，每组10只，4组均采用腹腔注射法，实验组裸鼠给予药物浓度均为15mmol/kg的IP6和Ins，合用组IP6和Ins以（1：1，V/V）合用，阴性对照组用0.1ml/10g生理盐水代替，每日一次。给药20d后处死裸鼠，分离肿瘤。观察瘤重和抑瘤率；采用westem-blot检测移植瘤组织中的Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果与对照组相比，实验组肿瘤均小于对照组，其中合用组肿瘤最小，但差异无统计学意义（P>0.05）。实验组Bcl-2和Bax的蛋白的表达水平降低（P<0.05），并且合用组的效果优于单独使用，P＜0.05。结论IP6和Ins联用可以抑制肿瘤生长，且上调Bax下调Bcl-2的蛋白表达，并且合用的效果优于单独使用。

【关键词】肌醇六磷酸；肌醇；裸鼠人肝癌皮下移植瘤；Bcl-2；Bax

EffectsofinositolandinositolsixphosphoricacidontheexpressionofBcl-2andBaxproteinofhumanlivercancerinnudemouse

Abstract：objective：toobservetheinhibitoryeffectofinositolsixphosphoricacid（IP6）andinositol（Ins）onthegrowthofxenograftsinnudexenograftsandtheeffectsontheexpressionofBcl-2andBaxintumortissues.Methods：Tosetupahumantransplantedtumormodelofhumanhepatomanudemice.Accordingtothesizeofthetumornodules，itisrandomlypidedintosalinegroup，IP6group，InsgroupandIP6+Insgroup，with10ratsineachgroup.Thesefourgroupsaretreatedwithintraperitonealinjection.TheexperimentalmousegroupisgivenIP6andInswiththeconcentrationof15mmol/kg，andthecombinationgroupofIP6andInsuse1：1，V/V.Thecontrolgroupisreplacedwith0.1ml/10gsalineonceaday.After20days，thenudemicearekilledandthetumorisisolated.Thetumorweightandtumorinhibitionrateareobserved.TheexpressionofBcl-2andBaxintransplantedtumortissuesisdetectedbywestem-blot.Results：comparingwiththecontrolgroup，thetumorsintheexperimentalgrouparesmaller，andthetumorinthecombinedgroupisthesmallest.Butthedifferenceisnotstatisticallysignificant（P>0.05）.TheexpressionlevelofBcl-2andBaxproteininexperimentalgroupdecrease（P<0.05），andtheeffectofcombinedgroupisbetterthanthatofsingleuse，P<0.05.Conclusion：thecombinationofIP6andInscaninhibitthegrowthoftumorandincreasetheproteinexpressionofBaxandreducetheexpressionofBcl-2.Andtheeffectofcombinationisbetterthaneachsinglegroup.

Keywords：inositolsixphosphate；inositol；subcutaneoustransplantedtumorofhumanlivercancerinnudemice；Bcl-2；Bax

肌醇六磷酸（IP6）作为一种含磷的天然植物化学物，大量存在于植物的种子、根干和茎中，尤其在豆科植物的种子、谷物的麸皮和胚芽中含量最高[1，2]。大量研究证明，IP6对于多种肿瘤均有抑制作用[3]。肌醇（Ins）是一种糖醇，对糖尿病[4]、多囊卵巢综合征[5]、心血管等代谢性疾病有治疗作用。国外实验发现：肌醇具有温和的抗癌活性，与肌醇六磷酸联用可以抑制结肠癌[6]和乳腺癌[7]的生长，二者合用的效果显著优于其中任何一种单独应用。我们课题组的前期研究显示，IP6和Ins合用能够使HepG2细胞的抑制效果增强。本实验主要通过二者联合应用对裸鼠皮下HepG2细胞移植瘤组织Bcl-2，Bax表达的影响，进一步探讨其抗肿瘤的机制。

1.材料

1.1实验细胞及实验裸鼠

人肝癌细胞HepG2：购于中国科学院上海细胞库。雄性BALB/c裸鼠共40只：购于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2主要试剂

IP6和Ins标准品购于成都曼斯特生物科技有限公司；westem-blot所用试剂购自碧云天生物技术公司、Bcl-2，Bax及β-actin抗体购自美国ProteintechGroup生物技术有限公司。

1.3人肝癌细胞培养及裸鼠人肝癌移植瘤模型的建立

人肝癌细胞HepG2用含10%胎牛血清和DMEM高糖培养基中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。40只BALB/c-nu雄性裸鼠，4～5w龄，体质量15～19g，SPF级条件下，适应性喂养一周。将含2×106个细胞的HepG2细胞悬液0.2ml，无菌条件下注射于裸鼠右前肢背部皮下，建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型。

1.4动物分组及给药

接种HepG2细胞约10d后，结节直径均大于5mm时，按裸鼠肿瘤结节的体积大小随机分为生理盐水组、IP6组、Ins组、IP6+Ins组，每组10只。各组药物根据裸鼠的体重不同配成不同体积，阴性对照组给予每日0.1ml/10g生理盐水，腹腔注射，连续用药20d。

1.5动物处理和瘤重、肝转移抑制率的计算

观察裸鼠的一般情况，每4天测定一次瘤体的大小。20天后，乙醚麻醉处死裸鼠，无菌条件下完整剥取裸鼠肿瘤，并称重，计算各组的抑瘤率。抑瘤率计算公式如下：

抑瘤率（％）=（对照组平均肿瘤质量-实验组平均肿瘤质量）/对照组平均肿瘤质量×100

1.6westem-blot方法检测移植瘤组织内Bcl-2，Bax蛋白表达情况

取肿瘤组织约50~100mg，称重后于冰上剪碎，加入RIPA蛋白裂解液，提取总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。然后在每组蛋白中加入上样缓冲液，混匀，加热，使蛋白变性。进行SDS－PAGE电泳分离，使分离后的蛋白分子转移到PVDF膜上。用含脱脂奶粉的TBST封闭2ｈ后，漂洗3次，分别加入稀释的一抗孵育3~4ｈ，一抗孵育结束后，TBST漂洗3次，重新加入二抗孵育2ｈ。加入ECL发光液，然后放入FusionFX5显影仪中显影，得到目的蛋白条带。蛋白的相对表达量用目的蛋白/内参灰度值来表示。实验重复3次，结果取均值。

1.7统计学分析

采用SPSS17.0软件对数据进行统计学处理，实验结果以±s表示，采用单因素方差分析进行组间差异检验，P＜0.05为差异具有统计学意义，实验至少重复3次。

２结果

2.1IP6、Ins及两者合用对裸鼠人肝癌移植瘤生长的影响

从表2.6中可以看出，与对照组比较，IP6组、Ins组及合用组的移植瘤的重量和体积均有一定程度的下降，合用组的肿瘤重量最低，体积最小，但差异无显著性意义（P＞0.05）。

表26裸鼠移植瘤的体积和瘤重分析（±s，n=10）

与对照组相比，IP6组、Ins组和IP6+Ins组Bcl-2蛋白的表达水平明显降低（p<0.05），Bax蛋白的表达水平明显升高，差异有统计学意义（Ｐ＜0.05）；IP6+Ins组的效果优于IP6组和Ins组，差异有统计学意义（Ｐ＜0.05）。

3.讨论

IP6可以预防肿瘤并且对肿瘤的生长有抑制作用。研究发现，IP6作用于HepG2细胞后，引起肝癌细胞的增殖抑制，并且能够通过线粒体路诱使HepG2发生凋亡［8］。IP6和Ins联用还能对结直肠癌和结直肠癌肝转移发挥更好的抑制作用。

本实验建立了裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型，IP6和Ins合用虽然没有对裸鼠人肝癌移植瘤的生长起到显著抑制作用，但通过westem-blot对凋亡相关因子Bcl-2、Bax的检测发现，与对照组比较，IP6和Ins均能显著下调Bcl-2蛋白，上调Bax蛋白的表达，且两者联用的效果优于其中任何一种单独应用。IP6和Ins对于癌症的防治具有重要意义，其抗肿瘤作用及其机制还有待于进一步研究。

参考文献：

[1]王芳.六磷酸肌醇和高含氧的甜没药烯型倍半萜化合物抗肿瘤活性及机理研究[J].见：王勤，主编.生物物理学.：兰州大学，2000.

[2]接德丽.肌醇六磷酸盐（钙、镁和锌）膜的制备及其传感器的应用[M].见：杨海峰，主编.分析化学.：上海师范大学，2012.

[3]Nawrocka-MusialD，Latocha.Phyticacid-anticancernutriceutic[J].PolMerkurLekarski，2012，33：43－73.

[4]DangNT，MukaiR，YoshidaK，etal.D-pinitolandmyo-inositolstimulatetranslocationofglucosetransporter4inskeletalmuscleofC57BL/6mice[J].BiosciBiotechnolBiochem，2010，74：1062－1067.

[5]李馨，宋扬，植酸对人肝癌细胞株HepG_2细胞周期及相关蛋白表达的影响.营养学报，2011（05）：p.476-479.

[6]刘敏，etal.，植酸通过线粒体途径诱导人肝癌细胞凋亡.中国公共卫生，2014（10）：p.1285-1288.

[7]王鹏，宋扬，高丽鹤，等．肌醇六磷酸或（和）肌醇对多种癌细胞增殖影响［J］.齐鲁医学杂志，2016，31（3）：301-303．

[8]连梓敏，曹定睿，王泓源，等.丙泊酚对Wistar大鼠肝癌模型中Bax与Bcl-2表达的影响[J].中国医学创新，2014，11（12）：28-30.