质粒介导的耐多药大肠埃希菌CTXM-22、CTXM24基因检测

质粒介导的耐多药大肠埃希菌CTXM-22、CTXM24基因检测

张正琼黄永茂(通迅作者)宋发兴史小玲

张正琼黄永茂(通迅作者)宋发兴史小玲陈庄陈枫

（四川省泸州医学院附属医院感染科四川泸州646000）

【摘要】目的了解本地质粒介导的耐多药大肠埃希菌的CTXM-22、CTXM24基因分布情况。方法用Ｋ-Ｂ法进行耐药菌株的筛选。PCR扩增CTXM-22、CTXM24基因。琼脂糖凝胶电泳检测基因大小。基因测序仪检测碱基序列。结果71株大肠埃希菌中,有一株死亡。全敏6株，占8.57%,单耐16株，占22.86%,双耐18株，占26.71%,耐多药30株，占42.86%。耐多药质粒中携带有CTXM-229株,12.86%。CTXM2424株，占34.29%。两种质粒均有的6株,占20%.结论泸州地区耐多药大肠埃希菌存在质粒介导的CTXM-22、CTXM24基因。耐多药的大肠埃希菌对第三代头孢菌素的头孢唑肟敏感，对头孢他啶，头孢哌酮，头孢曲松，丁胺卡那霉素中度敏感。对亚胺培南，美罗培南敏感。

【关键词】大肠埃希菌耐多药质粒介导CTXM-22CTXM24

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）17-0114-02

大肠埃希菌是感染性疾病中最常见的G－菌，其耐药性普遍存在，有对一种或者两种甚至多种抗生素耐药[1]，有染色体和质粒介导的耐药机制，本文仅讨论CTXM-22、CTXM24两种质粒介导的耐多药检测在本地分布情况,给临床选用抗生素提供一定的理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源泸州医学院于2007年至2008年收集的71株临床送检标本，来源于痰液，血液，腹水，分泌物等，无重复分离株，发现其中一株死亡。质控标准菌株ATCC25922系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.2抗菌药物纸片包括左氧氟沙星（LVF），诺氟沙星(NOR)，环丙沙星(CIP)，加替沙星（GAT），阿莫西林(AMX)，氨苄西林（AMP），哌拉西啉/他唑巴坦(PFP/TAZ),头孢唑啉(CFZ)，头孢他啶(CAZ)，头孢唑肟（CFX）,头孢曲松（CFT），头孢哌酮（CPZ），头孢噻肟(CTX)，头孢噻肟/克拉维酸（CTX/CA）,头孢西丁（FOX），头孢噻吩(CEF)，氨曲南(ATM)，庆大霉素(GM)，妥布霉素(TM)，链霉素(S)，丁胺卡那霉素（AMK）,亚胺培南(IPM)，美罗培南（MPM），均系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.3试验试剂LB粉，Augar粉，胰蛋白胨大豆肉汤粉，酪蛋白琼脂，酪蛋白粉，CTXM、CTXM3两种基因的PCR引物，质粒小提试剂盒，２×TaqPCRMasterMix，溴化乙锭，1倍的TBE，2000pb的Marker，均由上海生物工程有限公司生产。限制性核酸内切酶EcoRI，系美国Fermentas生物工程公司生产。BLOWESTAGAROSE系GeneTech(ShangHang)Company生产。大肠标准菌株ATCC25922，0.5硫酸钡比浊试剂系杭州天河微生物试剂公司生产。

1.1.4实验仪器天津上海跃进医用光学器械厂GNP-9082隔水式电热恒温培养箱，哈尔滨东名医疗仪器厂HZQ-C恒温空气摇床，上海安亭科学仪器厂TGL-16C型离心机，上海科析试验仪器厂XMTD型KXS恒温水浴箱，英国Hybaid公司Omn-EPCR扩增仪，北京六一仪器厂DYY-8C型水平电泳仪，上海顾村电光仪器厂ZF-90多功能暗箱式紫外投射仪，美国基因公司DNA/RNA800凝胶DNA成像仪，美国NanoDrop公司ND-1000蛋白核酸定量仪等。

1.2方法

1.2.1用制作的胰蛋白胨大豆肉汤，M-H液体培养基，LB液体培养基，37℃振荡培养细菌16小时，M-H固体培养基，LB粉与琼脂制作的LB琼脂平板培养24小时，细菌药敏试验K-B纸片法筛选出耐多药的大肠埃希菌。药敏试验判断标准按2006纪绍梅编著《微生物培养基质控与图解》[2]。不同的抗生素有不同的标准,分为耐药（Ｒ），中度敏感(Ｍ)，敏感(Ｓ)。菌液稀释以0.5麦氏单位硫酸钡比浊管浓度为标准。在直径９cm的平皿培养基上每个共放７个药敏纸片，两张纸片中心距离3cm，纸片与平皿边缘1.5cm，一株菌两个平皿。对三类或者三类以上的抗生素耐药的判定为耐多药。

1.2.2碱裂解法提取质粒按说明书操作，其中菌体量取1.5ml，加大P1,P2用量，加用去蛋白酶液。漂洗后在室温中开盖10分钟，彻底去掉其中的乙醇，避免影响后续反应。质粒洗脱液EB加100ul。

1.2.3CTX-M-22,CTX-M-24基因的扩增和克隆。30株耐多药的大肠埃希菌和大肠埃希菌标准菌株同时进行两种基因的扩增和克隆。两种基因引物信息见表１，PCR反应体系共35ul,其中模板7ul，引物1对各5ul，２×TaqPCRMasterMix15ul，ddH2tttO8ul。PCR反应循环的设置，94℃，预变性3min,94℃,变性30sec,55℃，退火30sec,72℃,延伸1min,共３０个循环,72℃再延伸5min。

表１两种基因引物信息表

1.2.4２%的琼脂糖凝胶电泳，１倍电泳液蒸馏水５倍稀释，标准菌株作为对照，电压100v，电流强度100MA,时间45分钟，电泳后用紫外光观察，阳性结果送上海生物工程有限公司测序仪检测基因序列。

2结果

2.1耐药菌株的检出情况通过K-B法药敏试验，71株大肠埃希菌,死亡一株，其中全敏６株，占8.57%;单耐16株，占22.86%;双耐18株，占26.71%;多耐30株,占42.86%。

2.2PCR产物电泳分析2%琼脂糖凝胶电泳结果，发现有9株扩增出891bp大小的条带，有19株扩增出876bp大小条带,标准菌株ATCC25922未见阳性条带。

2.3测序阳性条带经基因测序仪检测,与已知的CTX-M-22和CTX-M-24相比较，9株891bp条带为CTX-M-22，24株876bp条带为CTX-M-24,两种基因均含有的6株。

3讨论

耐多药大肠埃希菌有染色体和质粒介导的耐药机制,本研究发现质粒介导的30株耐多药大肠埃希菌中，CTX-M-22有9株，占30.0%，CTX-M-24发现24株，占80.0%，两种基因都有的6株，占20.0%，药敏试验表明70株大肠埃希菌对氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素体外实验表现有广泛的耐药性，以多耐占绝大多数，多耐菌株对第三代头孢菌素中的头孢唑肟敏感，其他第三代头孢菌素头孢曲松、头孢哌酮、头孢他定，丁胺卡那霉素中度敏感，对亚胺培南，美罗培南敏感。

近几年，在韩国首尔的一所医科大学研究发现大肠埃希菌中质粒介导的耐药基因CTM-M-22[3],还有我国在猪农场中[4]和其他细菌中也发现[5]。越南胡志明市的热带病医院发现CTM-M-24[6],加拿大的卡尔加里也发现了这种质粒[7]，本地菌株中也存在CTM-M-22,CTM-M-24两种耐药性质粒。可见，大肠埃希菌的质粒介导的耐药性全世界普遍存在。

大肠埃希菌的耐药机制广泛，主要是产生灭活酶、细胞壁的改变、主动外排以及作用靶位结构的改变。随着广谱抗生素、第三代头孢菌素及β内酰胺类抗生素的广泛应用，使耐药菌株不断产生。近年来发现更重要的是产生了耐药性质粒，且大肠埃希菌将耐药性质粒代代相传，还可以接受外源性的耐药性，有的菌株不仅一种甚至多种质粒共存。大肠埃希菌的耐药性在同种属甚至不同种属细菌的质粒之间或者质粒与染色体间不断转移，通过整合和重组使细菌产生多重耐药性。

随着国内外研究的深入,不断有新的耐药性质粒被发现,这就为我们研究新的对抗耐药细菌的药物指明了方向,更重要的是严格管理和控制抗菌药物在人类和动物的使用,才能对耐药菌的产生和传播进行有效的预防,遏制细菌耐药的加剧。避免人类治疗疾病陷入无药可用的尴尬境地，因为细菌变异耐药的程度远快于新抗生素发明的速度。

参考文献

[1]张洁,包其郁,张洪勤等.多重耐药性大肠埃希菌质粒谱与ESBLs基因型分析.中国抗生素，2006,31(4):198-204.

[2]纪绍梅编著.药敏试验判断标准,《微生物培养基质控与图解》.北京科学技术出版社，2006,254-258.

[3]SongW,LeeH,LeeKandsoon.CTX-M-14andCTX-M-15enzymesarethedominanttypeofextended-spectrumbeta-lactamaseinclinicalisolatesofEscherichiacolifromKorea.JMedMicrobiol.2009,58(2):261-266.

[4]TianGB,WangHN,ZouLK,andsoon.DetectionofCTX-M-15,CTX-M-22,andSHV-2extended-spectrumbeta-lactamases(ESBLs)inEscherichiacolifecal-sampleisolatesfrompigfarmsinChina.FoodbornePathogDis.2009,6(3):297-304.

[5]ShiWF,ZhouJ,QinJP,andsoon.Transconjugationandgenotypingoftheplasmid-mediatedAmpCbeta-lactamaseandextended-spectrumbeta-lactamasegenesinKlebsiellapneumoniae.ChinMedJ,2009,122(9):1092-1096.

[6]NguyenNT,HaV,TranNV,andsoon.ThesuddendominanceofblaCTX-MharbouringplasmidsinShigellaspp.CirculatinginSouthernVietnam.PloSNeglTropDis,2010,4(6):e702.

[7]PitoutJD,CampbellL,ChurchDL,andsoon,Molecularcharacteristicsoftravel-relatedextended-spectrum-beta-lactamase-producingEscherichiacoliisolatesfromtheCalgaryHealthRegion.AntimicrobAgentsChemother.2009,53(6):2539-2543.