TPO-IGF融合蛋白升血小板药效实验

TPO-IGF融合蛋白升血小板药效实验

刘贺煜1黄炎1王莹1李郑武1袁茵

刘贺煜1黄炎1王莹1李郑武1袁茵2王晴1

(1哈药集团生物工程有限公司150000；2中国药科大学药学院150000)

【中图分类号】R558【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)06-0054-02

【摘要】本试验的目的是观察供试品(TPO-IGF融合蛋白)腹腔注射对的血小板升高作用。通过给予骨髓抑制小鼠TPO-IGF融合蛋白的治疗可明显地减轻外周血小板计数的下降程度，促进血小板计数的恢复。TPO-IGF融合蛋白在0.5-50mg/kg的剂量范围内对骨髓抑制小鼠均有良好疗效，治疗10天血小板计数恢复到照射前水平。TPO-IGF融合蛋白的升血小板作用与其通过与其受体c-Mpl结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放有关。本试验结果表明，TPO-IGF融合蛋白的治疗对骨髓抑制小鼠可明显提高外周血血小板数，提示TPO-IGF融合蛋白可能是一种治疗血小板减少症的药物。

【关键词】TPO-IGF融合蛋白血小板生成骨髓抑制小鼠

原发或继发性造血功能障碍，尤其是严重血小板减少症状发生多、危害重、治疗难度大，如何促进血小板数量和功能恢复是造血重建领域研究的热点和难点之一。血小板生成素(TPO)是巨核细胞增殖、成熟和血小板产生的主要调节因子，并且在成熟血小板生成中，TPO的作用强于目前已知的几种相关造血因子。它通过与其受体c-Mpl结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，控制循环血中血小板的数量和功能。然而作为一个含300多个氨基酸残基的蛋白质，它也存在着免疫原性强、制备成本高以及引起副作用等方面的不足。

利用噬菌体肽库筛选到一种与TPO无序列同源性而具有与其相似功能的模拟肽。体外实验显示这段由14个氨基酸构成的短肽与c—Mpl受体有很高的亲和力，具有刺激rhTPO依赖性细胞株Ba/F3/c-mpl的增殖功能。但由于血小板生成素模拟肽(TMP)是14个氨基酸的短肽，在体内不稳定，极容易降解，而且不容易用基因工程的方式制备。

胰岛素样生长因子-1（IGF-I）是一种从血清中发现的具有促进多种细胞生长功能的活性多肽，由70个氨基酸残基组成的单一肽链生长因子组成，其一级结构与胰岛素有很高的同源性，属于同一基因家庭，并且在体内体外都具有部分胰岛素的代谢调节功能。经研究表明，IGF是动物生长的直接调节物，能够刺激多种细胞的增殖与分化，促进蛋白质的合成和结缔组织及骨髓的产生。而且IGF-I还能与一些生长因子合用，可促进相应细胞的分化成熟，例如，IGF-I与红细胞生成素合用，能刺激红细胞的成熟；与单核粒细胞集落刺激因子合用能刺激粒细胞的生成与成熟。IGF-I刺激RNA，DNA的合成和细胞增殖，特别是对细胞的有丝分裂具有重大意义，其对骨．肌肉、脂肪组织、肝、肾、脑，的生长都有重要作用。

由于IGF-I具有广谱的促进细胞生长的作用，因此将IGF-I与TMP融合，可通过与TMP受体c-Mpl结合而刺激巨核细胞增殖与分化，并促进血小板的生成和释放，加强TMP促进血小板生成作用。与天然TPO比较，具有更好的升血小板的作用。TPO-IGF融合蛋白是利用基因重组技术将血小板生成素模拟肽(TMP)与胰岛素样生长因子IGF-I通过连接肽进行连接，通过大肠杆菌表达系统同时表达TMP与IGF-I，具有这两种多肽的生物学活性，纯化方法简单。

1材料与方法

1.1材料

TPO-IGF融合蛋白原液由哈药集团技术中心提供。批号990615，比活性(7-9)×106U/mg，冻干粉剂，含量每支750/g，4℃下保存。腹腔注射前用氯化钠注射液新鲜配制。

阳性对照药特比澳，沈阳三生制药有限责任公司，每支15000IU/1ml，批号为20090601，4℃下保存。腹腔注射前用氯化钠注射液新鲜配制。

注射用卡铂波贝，齐鲁制药有限公司，批号8030032ES，避光保存。注射前用氯化钠注射液新鲜配制。

Balb/c小鼠雄性，20-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠群养，每笼10只，自由摄食及饮水，12小时交替光照。动物房温度22-26℃，相对湿度40％-60％。

1.2方法

骨髓抑制造模所有小鼠照射60Co3.5Gyγ线全身照射，照射率146.1伦/分。照射后腹腔注射1次卡铂50mg/kg。[1]

分组及给药方法：，每组10只动物。各组TPO-IGF融合蛋白的剂量分别为50mg/kg，5，mg/kg和0.5mg/kg，腹腔注射，每日1次，注射卡铂后24h开始给药，连续10天，停药后继续观察4天。此时给药动物血小板下降至给药前水平，结束试验。阳性对照组给予特比澳1.1×103/kg。模型对照动物腹腔注射0.5ml氯化钠注射液。

1.3观察指标

所有小鼠的造模前，给药后7天，10天，14天血样的外周血血小板计数。

2结果

对外周血血小板数的影响观察期间各组动物外周血血小板计数的动态。

小鼠经过60Co照射和腹腔注射卡铂后造模，本次实验通过模型组造模前后的血样检测表明，经过造模后小鼠血小板计数明显减少，且血小板计数在14天内依然维持在一个较低水平，表明本实验所采用造模方法可形成骨髓抑制，可以用于评价提高血小板计数药物疗效。

试验数据表明，TPO-IGF融合蛋白的三个剂量组的模型小鼠，在给药后7天、10天和14天，其血小板计数降低幅度明显低于模型组。50mg/kg组治疗效果最佳。其中5mg/kg组与阳性药作用相当。

3讨论

临床上化疗及骨髓移植后患者可出现严重的血小板减少，传统的治疗方法是输注血小板。[2]近年来出现了一些升高血小板的生物类药物，在临床上具有良好的应用。

传统的骨髓抑制模型是单一注射细胞毒类抗肿瘤药物或是进行放射线辐照。此类模型持续时间短死亡率高，很难用于药物的评价。本试验同时采用注射卡铂和放射线辐射，并降低造模药物的剂量。本次试验形成骨髓抑制模型无一只小鼠死亡，且能稳定持续14天。此造模方法要优于传统方法。[3]

本次试验结果表明TPO-IGF融合蛋白能够显著抑制小鼠外周血血小板的减少，显示出较强的升血小板功能。供试品的各给药组中，各组剂量均能明显的升高血小板计数，且存在量效关系。其中高剂量组血小板计数并未超过正常水平的血小板计数。提示供试品具有升高血小板计数能力，并不会血小板计数超高。

参考文献

[1]徐明波，王勇波，易辉，冯宇霞，李涛，刘秀珍，黄向东.重组人白细胞介素11对正常及骨髓抑制小鼠的促血小板生成作用左从林.中国实验血液学杂2000；8(1).

[2]臧维革，魏旭东，王申五，王德炳.电脉冲介导的TPO基因转移对正常及实验性血小板减少小鼠的促血小板生成作用.中华血液学杂志2001年3月第22卷第3期.

[3]左从林，徐明波，王勇波，易辉，冯宇霞，李涛，刘秀珍，黄向东.重组人白细胞介素11对卡铂所致猴血小板减少症的治疗作用.中国实验血液学杂2000；8(1).