儿童原发性肾病综合征症尿液外液体miR-23b-3p水平变化及临床意义

儿童原发性肾病综合征症尿液外液体miR-23b-3p水平变化及临床意义

郭钢

（岳阳市爱康医院湖南省岳阳市414000）

摘要：目的检测原发性肾病综合征（primarynephroticsyndrome，PNS）患儿血清中（miR-23b-3p）的表达水平，探讨其在PNS治疗中的临床意义。方法收集40例PNS患儿，糖皮质治疗反应程度分为激素敏感型、激素抵抗型各20例，及本院20例年龄、性别相匹配的健康儿童（对照组）的晨尿标本及临床资料。实时荧光定量PCR检测miR-23b-3p在尿液外液体中的含量。分析血清miR-23b-3p与PNS的相关性。结果与健康组对照PNS患儿血清的表达水平升高（p＜0.05）。SSNS组治疗后miR-23b-3p的表达水平相比治疗前下降（p＜0.05）结论PNS患儿血清中miR-23b-3p表达具有提示儿童NS辅助诊断治疗效果检测潜能指标。

关键词：肾病综合征；miR-23b-3p；尿液外液体

小儿特发性肾病综合征（nephroticsyndrome，NS）属于儿童的慢性肾小球疾病，主要归因于免疫介导的炎症性疾病和基因突变。主要症状是严重的蛋白尿和低蛋白血症，以及作为主要临床诊断指标的高脂血症和水肿，外泌体在诸如血液，精液，唾液，汗液和尿液等体液中被发现[1]其在神经退行性病变、肿瘤、自身免疫性疾病等方面的作用已有初步研究。外泌体源性miRNA有可能成为疾病诊断的新指标、靶向性治疗的新途径，有助于某些疾病的早期诊断和早期治疗。

1.临床资料及方法

1.1.病例组

2018年3~11月在本院住院并确诊的40例NS，年龄9个月至11岁，其中男24例，女16例，男性平均年龄6.8±4.2岁，女性平均年龄7.6±2.1岁；对照组20例，来源于健康体查的儿童，经体格检查、胸部X线片、尿常规、肝肾功能、乙肝病原检验及心电图等检查，确认为健康的儿童。年龄从5岁6个月至12岁4个月，其中男8例，女12例，男性平均年龄9.0±1.4岁，女性平均年龄9.1±1.2岁；PNS的诊断依据2000年中华医学会儿科学分会肾脏病学组珠海会议制定的《关于小儿肾小球疾病的临床分类、治疗的建议》的标准[3]。即：PNS患者具备大量蛋白尿（+++）~（++++），1周内3次24h尿蛋白定量≥50mg/kg；血浆白蛋白低于30g/L；血浆胆固醇高于5.7mmol/L；不同程度的水肿。其中大量蛋白尿和低蛋白血症为必要条件。将40例PNS患儿根据糖皮质治疗反应程度分为激素抵抗行型及激素敏感行型。收集PNS患儿治疗前的血样和尿样，分离血清，同时收集SSNS组、SRNS组患儿糖皮质激素治疗后的血样，分离血清。样品均放于-80℃用于检测miR-23b-3p的表达水平。

1.2方法

1.2.1标本收集及处理：收集NS患儿入院治疗前及健康对照者的晨尿8ml，室温下3000×g离心10min，除去细胞及细胞碎片，收集离心后的上清，于一80℃冰箱保存。

1.2.2尿液外泌体提取：将尿液标本在4℃，3000g离心30min，取500μl上清液，根据外泌体提取试剂盒说明书加入100μIExoQuick试剂，混匀离心提取外泌体。

1.2.3外泌体总RNA提取：按本课题组前期建立的方法，用Trizol法提取外泌体中的总RNA使用20μl的DEPC水溶解保存于-80℃待用

1.2.4实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：基于Taqman探针的qRT-PCR方法检测尿液外泌体miR-23b-3p水平。

1.3.5尿蛋白和血清学指标测定：尿常规尿蛋白测定用干化学法；血清Alb，TP，TC，TG用日立7600型全自动生化分析仪进行定量检测。

2结果

2.1PNS组与健康组血清何尿液表达miR-23b-3p水平见表一。

2.2ROC曲线分析ROC曲线分析显示尿液外泌体miR-23b-3p能够较好地区分NS患儿和正常对照，其AUC为0.796（95%CI：0.734~0.858）。当cutoff值为4.26时，miR-23b-3p诊断NS的敏感度为84.7%，特异度为64.2%。此外，miR-23b-3p在区分治疗缓解后患儿的AUC为0.830（95%CI：0.742~0.917）。在cutoff值为6.96时，其敏感度为65.9%，特异度为90.2%。

3.讨论

小儿特发性肾病综合征（nephroticsyndrome，NS）是一种常见于儿童的慢性肾小球疾病，主要归因于免疫介导的炎症性疾病和基因突变。每100，000名儿童中约有1.15至16.9名患有NS。NS伴随严重的并发症，包括细菌感染、血栓栓塞和脂质异常。NS的主要症状是严重的蛋白尿和低蛋白血症，以及作为主要临床诊断指标的高脂血症和水肿，但由于症状和并发症的多样性，这些症状可能不是患者预后的准确预测因子。肾组织活检是判断病理类型和进展的标准方法，是一种具有潜在风险的侵入性方法，通常不适用于连续监测，尤其是儿童。此外，不适当的组织取样可能会引起误诊。因此，需要为该疾病找到新的非侵入性诊断和预后生物标志物。此外，miR-194-5p和miR-23b-3p的浓度与尿蛋白含量显著正相关，且在高尿蛋白组明显高于低尿蛋白组。该研究找到了尿液外泌体中显著增加的miRNA及其诊断和监测价值，有望作为特异性小儿NS的有潜力的液体活检工具。探索成本适中且成熟可靠的检测技术，进一步明确外泌体中与疾病相关联的miRNA的种类及生物特性，以外泌体中的疾病特异性mirna为突破点，构建靶基因-靶mirna-蛋白网络，从基因及蛋白层面揭示疾病的发病机制；寻求新的技术，如将外泌体作为载体转染miRNA或者miRNA拮抗剂，从而精密地调控靶蛋白的表达水平，作为疾病新的靶向手段，切实造福患儿。

参考文献

[1]熊灏，潘爱萍，佘尚扬.紫癜性肾炎病理分级与临床分型及血浆高敏C-反应蛋白的关系[J].国际检验医学杂志，2012，33（9）：1136-1137.

[2]谢永新，杨丹，宋明辉.肾病综合征患者血清hs-CRP与Hcy相关性分析[J].国际检验医学杂志，2012，33（17）：2157-2158.

[3]星学花.超敏C反应蛋白在儿童原发性肾病综合征中的临床应用价值[J].现代预防医学，2013，40（4）：635-636.

[4]向代军，王成彬，马骏龙，等.血清C反应蛋白、纤维蛋白原与原发性肾病综合征相关分析[J].解放军医学院学报，2013，34（2）：124-126.

[5]杨世峰，尹爱萍，谭峰，等.原发性肾病综合征与血清超敏C反应蛋白相关分析[J].第四军医大学学报，2009，30（16）：1520-1522.