探讨液相色谱条件及系统适用性试验的发展趋势与存在问题

探讨液相色谱条件及系统适用性试验的发展趋势与存在问题

梁惠明吕琼芳

（江门药品检验所广东江门529000）

【摘要】目的：探讨化学药质量标准中液相色谱条件及系统适用性试验的发展趋势与存在问题，并提出了建议与同行们商榷。方法：列举几例HPLC法实验，比较其色谱条件及系统适用性试验在不同版本标准中的要求。结果与结论：随着质量标准的不断提高，色谱条件及系统适用性试验也不断完善，同时也带来一些问题，应予以重视。

【关键词】化学药；HPLC法；系统适用性试验

【中图分类号】R927【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）28-0345-02

高效液相色谱法（HPLC法）系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法[1]。中国药典规定此法需满足一定的色谱条件及系统适用性要求。色谱条件包括色谱柱、检测器、及流动相；系统适用性实验通常包括理论塔板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。HPLC法快速、准确、专属性强，在药品检验中得到了广泛的应用，随着检验技术的快速发展，在质量标准中，对液相色谱条件及系统适用性试验的研究越来越深入，相应的要求也越来越高。

1.实例

笔者从实践检验工作中列举几例HPLC法实验，仅就色谱条件及系统适用性试验在不同版本标准中的要求，讨论其发展趋势与存在问题。

1.1茶碱缓释片

2005年版没有项目使用HPLC法，无有关物质检查。

2010年版有关物质检查使用HPLC法，规定用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以醋酸盐缓冲液（取醋酸钠1.36g，加水100ml使溶解，加冰醋酸5ml，再加水稀释至1000ml，摇匀）-乙腈（93:7）为流动相，检测波长为271nm。另取茶碱和可可碱各适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中各含10μg的溶液，作为系统适用性溶液。取系统适应性试验溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，理论板数按茶碱峰计算不低于5000，可可碱峰与茶碱峰的分离度应大于2.0[2]。

2015年版规定同2010年版。

1.2盐酸特比萘芬乳膏

在收入2015年版药典之前为新药转正标准，标准编号为WS1-(X-115)-2004Z。其含量测定使用HPLC法，只规定了理论板数。

2015年版优化了色谱条件及增加了系统适用性试验，规定用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（3.0mm×150mm，5μm或效能相当的色谱柱）；以三乙胺缓冲液（取0.2%三乙胺溶液，用冰醋酸调节pH值至7.5)-甲醇-乙腈（30:42:28)为流动相A，以三乙胺缓冲液-甲醇-乙腈（5:57:38)为流动相B，按一定程序进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml；检测波长为280nm。取盐酸特比萘芬适量，加乙腈-水（1:1)溶解并稀释制成每lml中约含1mg的溶液，置紫外光灯（254nm）下照射1小时，取20μl注人液相色谱仪，记录色谱图，特比萘芬峰的保留时间约为16分钟，在相对保留时间0.8～1.2之间应有三个较大杂质峰，相对保留时间分别约为0.87、0.95与1.1。特比萘芬峰与相对保留时间约0.95、1.1处的杂质峰间的分离度均应大于2.0[3]。

1.3硝酸甘油片

2005年版含量测定使用HPLC法，规定了理论板数和分离度。

2010年版增加了系统适用性实验，规定取硝酸甘油对照品适量，用1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，置100℃水浴中加热30分钟，放冷，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，取20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，在相对保留时间约0.5处应出现明显的降解物峰（二硝酸甘油），理论板数按硝酸甘油峰计算不低于2000[2]。

2015年版推荐了具体品牌色谱柱并优化了系统适用性实验，规定用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(推荐VenusilMPC18250mm×4.6mm，5μm柱或效能相当的色谱柱)；以乙腈-水（50:50）为流动相；检测波长为215nm。取硝酸甘油对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，置水浴中加热10分钟，放冷，用0.1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至中性，作为系统适用性溶液，取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，在相对保留时间约0.4处应出现两个降解物峰（1，2-二硝酸甘油峰和1，3-二硝酸甘油峰），两峰之间的分离度应大于1.0。理论板数按硝酸甘油峰计算不低于2000[3]。

2.讨论

对于茶碱缓释片，新版药典对色谱条件未做修订，但笔者在实际工作中，分析多批样品，并未检出可可碱峰，系统适用性溶液选择的合理性有待商榷，建议标准对方法进行修订使其设计与实验目的更加匹配。

对于盐酸特比萘芬乳膏，新药转正标准只对理论板数作规定，2015年版药典对色谱条件进行了修订并增加了系统适用性试验要求。而在实际分析中发现，主峰的保留时间难以满足要求，系统适用性试验的溶液制备在紫外灯254nm下照射1h，有相对保留时间为0.72、0.87、0.95和1.1的降解峰出现，相对保留时间为0.87和1.1的杂质峰实际上峰面积非常小，而相对保留时间0.72的杂质峰峰面积较大，容易让人对“在相对保留时间0.8～1.2之间应有三个较大杂质峰”这句话产生误解，影响判断；操作中还发现，随着紫外灯的强度及照射时间的延长，杂质峰的强度会增大，建议光照时间视实验条件适当延长。因此建议对系统适用性实验作进一步研究，使其可操作性更强。

对于硝酸甘油片，2005年版只规定主峰的塔板数及与相邻杂质峰的分离度，2010年版增加了系统适用性溶液并规定了降解物峰的相对保留时间，而在实际分析时，发现在相对保留时间0.5附近有2个明显的降解物峰，2015年版对此又进行了优化，对两个降解物峰作了明确规定，使实验更合理更有利于准确判断。同时，现行标准中注明了色谱柱的具体品牌与规格，这是此版药典的一大进步，多个品种出现相似的情况如盐酸雷尼替丁胶囊、阿卡波糖胶囊等，这样有利于检验人员节省摸索条件的时间，方便操作，但也增加了检验成本，体现出方法的耐用性不强，因此笔者认为如何利用先进的技术快速、简便地达到实验目的值得思索。

3.小结

从以上实例看出化学药质量标准中，液相色谱条件与系统适用性试验在不断发展，不断完善。2005年版药典HPLC法应用的较少，要求较低，从2010年版开始广泛应用HPLC法，并强化色谱条件与系统适用性试验，到2015年版发展迅速，大大优化了各方面指标，对杂质的定性、主峰与特定杂质峰的具体保留时间等进行了细致的规定，系统适用性溶液的制备更具可操作性和实用性，试验更加严谨细致。

现行标准扩大了现代分析技术的应用，进一步将先进、成熟的检测技术应用到药品检验中，将促进药品质量的整体提高，对于保障公众用药安全有效意义重大。同时现行标准还存在一些问题，一方面有的品种多年来未作提高或提高的力度不大，有待完善；另一方面现行标准的高要求也会带来如系统适用性试验规定的条件难以达到、色谱条件的耐用性不强、所需的对照品和杂质对照品供应紧缺等问题，希望引起起草部门关注。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(四部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：59.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：513、947-948.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2015：1063、1292.