浅谈凝胶法细菌内毒素检查中应注意的几个环节

浅谈凝胶法细菌内毒素检查中应注意的几个环节

王欣放

王欣放（辽宁省朝阳市食品药品安全监督所122000）

【中图分类号】R96【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2013）05-0148-01

细菌内毒素检查是利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机制，判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。是控制注射剂药品质量的一项重要检测项目，《中国药典》2010年版二部将细菌内毒素检查法分为凝胶法和光度测定法。因凝胶法具有最简单、经济，结果准确，应用最广泛，对干扰不敏感的优点，且当两种方法有争议时以凝胶法结果为准，因此其作为《中国药典》的“仲裁”检查方法[1]，而广泛用于注射剂药品细菌内毒素的检查。鲎试剂与细菌内毒素的反应为多级酶促反应，生物酶反应受许多因素的影响，试验过程中涉及到的标准品、鲎试剂、检查用水及干扰因素等，均会对实验结果造成不同程度的影响，笔者根据实际工作经验，对细菌内毒素检查工作中应注意的问题进行了归纳总结，认为应注意以下几个环节，以保证实验结果的准确性。

1实验室环境

细菌内毒素检查（BET）实验不需要在洁净房间或高效空气过滤环境中进行。日常细菌内毒素检查实验一般在洁净的实验环境下操作，避免较大空气对流引起尘埃飞扬。实验室温度应控制在25℃以下，防止强光照射。操作台不要对着通风口，操作前须洗手，穿工作服和戴口罩，防止污染。用于凝胶法反应的恒温器需放置在温度稳定，无振动的环境中。鲎试剂与内毒素所形成的凝胶是不可逆的，一旦凝胶受到振动就容易变形脱落，造成假阴性结果。

2实验材料

2.1鲎试剂灵敏度复核试验

鲎试剂是一种生物制剂，其稳定性受多种因素的影响。为了保证细菌内毒素检查结果的准确性，因此使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，必须进行鲎试剂灵敏度复核试验后才能用于正式试验。另外，实验用细菌内毒素检查用水内毒素含量应小于0.015Eu•ml-1（凝胶法）[2]而且有严格的pH值（6.0～8.0）范围。如检查用水不合适的pH值可能会引起内毒素的衰减而导致阳性对照无效。应选用中检院或鲎试剂厂家配备的细菌内毒素检查用水。

2.2标准细菌内毒素溶液的制备

由于具有两级活性的内毒素分子在水中呈不均匀分布，细菌内毒素工作标准品稀释时混合时间与效价有一定的关系。细菌内毒素工作标准品溶解后要在旋涡混合器上混合15min，以后每一步稀释前至少混合30s，否则有可能使内毒素的活性与标示值不一致。造成阳性对照不凝等不正确实验结果。

3实验操作

3.1操作熟练程度

操作时严格按无菌操作法进行，安瓿开启前用砂石划痕，再用75%酒精棉擦拭消毒后将颈部折断，一定要避免碎玻屑掉入安瓿内。在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应选择合适量程、精度的移液管量取，保证读数准确。应用移液管时应注意不可用洗耳球吹吸液体，以免由于洗耳球反复吹吸污染溶液。应利用虹吸原理来吸取液体。加样应用经过校准的移液器而不用刻度吸管。因为刻度吸管加样速度慢，延长操作时间而且加液量准确性差。鲎试剂在液态时极不稳定，在室温放置太久会影响反应灵敏度，而且在室温环境下样品或内毒素溶液与鲎试剂混合后，马上就会发生反应。所以加样结束后应迅速用封口膜封闭管口，并立即放入恒温保温箱中。整个操作过程中时间应紧凑，防止微生物的污染，否则易致假阳性的出现。

3.2保温温度

温度对生物酶的活性有重要的影响，一般为温度高活性强，反应速度快。故应严格按照药典的要求，温度控制在(37±1)℃之间，才可获得准确的结果。使用恒温水浴箱须给每支反应试管一一封口，既麻烦费时又延长了反应的时间，影响实验精度。而且水浴箱加热不均匀，容易造成鲎试剂反应的差异。建议最好使用干式恒温仪。干式恒温仪有遮光防尘盖，试管不用封口，可以节省操作时间，而且加热温度稳定均匀，方便快捷。

3.3保温时间

实验证明，延长保温时间，可以提高鲎试剂的灵敏度。增加假阳性的发生率。对于内毒素含量处于边缘值的样品，准确的保温时间非常重要。边缘值样品有可能保温在58min之内为阴性结果而保温到62min之后就变成阳性结果。故应严格遵守我国药典规定的保温(60±2)min时间。在凝胶法操作中应防止试管受到振动，鲎试剂与细菌内毒素形成的凝胶受到振动后易变形而误判断为阴性。保温过程中不可随时取出观察，观察结果时，要动作轻柔，缓缓倒转180°，避免引起振动，出现假阴性结果。

4实验器具

用于取样、贮存或稀释的容器应无内毒素，对实验无干扰作用。清洗玻璃器皿时要注意最后必须用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。因为纯化水中存在各种离子有可能对酶反应产生抑制或增强作用。实验用器皿均应洗涤并冲洗干净，特别是接触酸碱或洗液等洗涤后，更应冲洗干净，以免残留物干扰实验结果。灭菌方法和时间应严格按《中国药典》中的要求处理，防止引入外源性内毒素。

总之，为了保证细菌内毒素检查结果的准确性、真实性，我们要选择合适的实验环境、器具，严格按照操作规程进行实验。注意操作的细节，防止污染。严把药品质量关，保证临床用药的安全。

参考文献

[1]中国药典二部[S].2010.附录99.

[2]中国药品检验标准操作规范[S].2010.311.