早产儿脐血干细胞定向培养细胞免疫的研究

早产儿脐血干细胞定向培养细胞免疫的研究

叶春华1陈敬国1方慧云2郑竞红3

叶春华1陈敬国1(通讯作者)方慧云2郑竞红3

（1中山市人民医院儿科广东中山528403）

（2中山市人民医院肿瘤研究所广东中山528403）

（3中山市小榄人民医院产房广东中山528415）

【摘要】目的探讨早产儿脐血干细胞定向培养细胞免疫的意义。方法收集30例早产儿，留脐带血标记后进行分离、诱导、分化、扩增培养，培养前后监测早产儿脐血的CD3,CD4,CD8,CD4/CD8水平。结果培养前：CD3(60.32±5.67)%,CD4(24.88±5.02)%,CD8(18.43±4.07)%,CD4/CD8(1.25±0.25)%。培养后分别为(70.32±5.71)%,(58.88±5.21)%,(26.43±4.08)%,(2.01±0.25)%。t检验,P均<0.05,差异有显著性意义。结论早产儿细胞免疫功能低下，脐血干细胞可定向培养细胞免疫体系，为干细胞移植作好准备。

【关键词】早产儿脐血干细胞细胞免疫

【中图分类号】R722.6【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）05-0197-02

新生儿的细胞免疫不成熟，功能不完善，早产儿更是如此。早产儿由于全身各脏器的发育不够成熟，皮肤表层薄嫩，脐部也是一个开放性的伤口，对各种感染的抵抗力极弱，即使轻微感染也可发展成为败血症。如何增强早产儿的免疫功能已成为目前研究的热点。脐带血是指新生婴儿脐带在被结扎后存留在脐带和胎盘中的血液，含有大量的干细胞，是成体干细胞的主要来源之一，在适宜的体内或体外环境下可分化为免疫细胞，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子调节免疫反应，从而发挥免疫重建的功能[1]。由此我们进行了早产儿脐血干细胞定向培养细胞免疫体系的研究,现报告如下：

1对象及方法

1.1研究对象：收集30例早产低出生体重儿患者，男18例，女12例，胎龄28-34周，出生体重850-1498g，家属均签字同意接受脐血干细胞定向培养细胞免疫体系的研究。

1.2方法：产妇及家属对实验知情同意，实验经医院伦理委员会批准。早产低出生体重儿娩出后，立即断脐，消毒脐带侧，行脐静脉套管插管，脐带血借宫缩力及位差重力作用流入血袋内（内含ACD-B液），摇动混匀，直至无脐血流出为止。将采集的脐带血置于4～10℃冰箱中暂存。将采集所得单人份脐血50mL左右，于4h内，用1.077g/mLFicoll-Hypaque液分离单个核细胞。吸取界面层白细胞洗涤，用IMDM培养液（加入体积浓度为20%的类标准胎牛血清）采用血细胞计数板调整至细胞浓度为2×108L-1。将调好浓度的细胞悬液置于24孔细胞培养板中培养。每孔加入细胞混悬液1mL。将此培养体系置于37℃、体积浓度为5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养7～10d。每4d补充等量的新鲜培养基。检测扩增效率：细胞培养24，48，72h吹打混匀各孔细胞悬液，取适量悬液MTT法测定细胞增殖率。以只加培养液的培养皿为空白对照。计算细胞增殖率。细胞增殖率=实验组A值/对照组A值×100%。培养前后监测标本血CD3,CD4,CD8,CD4/CD8水平。CD3,CD4,CD8,CD4/CD8采用美国进口的流式细胞仪检测,仪器型号为COULTEREPICSXL,试剂由法国免疫公司提供。

1.3统计方法：采用SPSS13.0统计学软件进行数据统计，用t检验比较差异性。

2结果

T细胞亚群CD3,CD4,CD8,CD4/CD8比值脐血干细胞定向培养后，细胞免疫功能较培养前升高(P<0.05),其中CD4升高最明显(P<0.01),差异有显著性意义,见表1：

表1T细胞亚群检测(%)(x±s)

3讨论

早产儿一般未接触过子宫外环境的各种病原，也没有接触过食物蛋白等种类繁多的抗原性物质,早产儿白细胞的生产及储备都比较少，当患有感染及严重疾病时，白细胞消耗增加，吞噬功能和杀菌活性都可能明显降低。早产儿存在着生理性免疫低下,全身各脏器的发育不够成熟，皮肤表层薄嫩，很容易擦伤引发感染；脐部也是一个开放性的伤口，细菌容易在此处繁殖并进入血液，故对各种感染的抵抗力极弱，即使轻微感染也可发展成为败血症[2]。

随着免疫生物分子学的开展,发现T淋巴细胞由于其功能和表面标志不同,分为6种不同的亚群,其中最重要的是诱导-辅助性T细胞(CD4)及杀伤性-抑制性T细胞(CD8)。CD4T细胞亚群能释放多种淋巴因子,如巨细胞移动抑制因子、细胞活化因子、趋化因子、淋巴毒素、皮肤反应因子等,使局部出现以单个粒细胞浸润为主的炎症反应;CD8T细胞亚群通过分泌T细胞因子即TsF,抑制CD4细胞功能。正常情况下,其在免疫应答过程中互相协调和制约,以形成适度的免疫应答,使之既能清除抗原性异物,又能不损伤机体组织。当CD4细胞功能低下或CD4/CD8低于正常时,机体免疫力下降,易发生感染;若CD4细胞功能增强、CD8细胞功能低下或CD4/CD8高于正常时,则机体易发生过强的免疫应答,引起过敏表现。所以在临床上经常检测患者外周血液中T细胞亚群或CD4/CD8比值,以帮助疾病的诊断或发病机制的研究[3]。本研究中早产儿脐血干细胞定向培养细胞免疫体系前CD4,CD8均低下,且以CD4低下明显,CD4/CD8亦低下,显示患儿细胞免疫功能是低下的。所以早产儿容易发生感染,并引起病情反复。

虽然每个婴儿脐带中只有少量的血，但这些血液中含有大量的干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下可分化为免疫细胞，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子调节免疫反应，从而发挥免疫重建的功能。且来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性[4]。通过自体移植可以重建组织器官的结构和功能，并且可避免免疫排斥反应。本研究显示早产儿脐血干细胞可定向培养细胞免疫体系，改善免疫功能，为干细胞移植作好准备。

参考文献

[1]QiuL,MeagherR.,HerzigR.H,etal.ExvivoexpansionofCD34+umbilicalcordbloodcellsinadefinedserum-freemedium(QBSF-60)withearlyeffectcytokines［J］.J.Hematotherapy&StemCellRes,1999,8(6):609-618

[2]董永绥.儿科免疫学.特异性免疫和小儿特点[M].武汉:湖北科学技术出版社,1998,7-19.

[3]曾上勤,周同莆,何志旭.静脉丙种球蛋白对小鼠病毒性心肌炎T细胞亚群NK细胞及部分细胞因子的影响研究[J].华西医科大学学报,1999,30(3):289-292.

[4]杨国荣译自加藤俊一.脐带血移植的现状和展望[J].日本医学介绍，2000，21（9）:417.