BRAF基因在甲状腺癌细针穿刺标本中的表达研究

BRAF基因在甲状腺癌细针穿刺标本中的表达研究

谢庆富，王凤霞，张春玲

山东省平度市人民医院，266700

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，约占所有恶性肿瘤的1%—4.42%，以45~50岁多见，国内普查报道甲状腺癌发病率为11.44/10万，近年来其发病率呈增高趋势，近十年中国甲状腺癌发病率升高

3.9倍，是所有实体肿瘤中，发病率上升最快的癌症。每年全世界约有122000例新发病例，男女发病率之比约为1：（3~4），男性约（0.8~5.0）/10万，女性约（1.9~19.4）/10万。虽然发病率升高明显，但病死率并没有升高，约占癌症死亡病例的0.4%。其中甲状腺乳头状癌（papillarythyroidcarcinoma，PTC）占75%-85%。对于甲状腺结节性质的诊断主要依靠彩超和甲状腺细针穿刺（fineneedleaspiration，FNA）细胞学检查。BRAFV600E基因突变是PTC最常见的遗传学因素，也是甲状腺癌变过程中的早期事件。本研究选取53例术后病理证实的甲状腺乳头状癌患者，术前经过UG-FNA检查提示见核异质细胞，制备细胞蜡块行免疫组化检测BRAFV600E突变蛋白表达，并与术后石蜡标本中BRAFV600E的表达进行对照，以检测该方法可靠性。

1资料与方法

1.1一般资料：选取我院2014年7月至2017年3月甲状腺乳头状癌病例53例，其中男性11例，女性42例；年龄32~69岁。平均年龄41岁。本组44例患者行患侧甲状腺腺叶+峡部+中央区淋巴结清扫，9例行功能性颈淋巴结清扫术。同时选取10例结节性甲状腺肿或甲状腺腺瘤良性病例石蜡标本进行对照。

1.2穿刺方法和标本制备。UG-FNAB穿刺方法：术前常规检查凝血功能，并停用抗凝药物5~7d以上，告知患者穿刺注意事项，征得患者同意后签署知情同意书。进行FNA时，患者取仰卧位，肩下垫枕使颈部过伸，首先应用高频超声探头确定穿刺靶区，选择穿刺点，穿刺路径应避开喉返神经、血管、气管所在区域，确定肿块部位、大小、活动情况、最浅表处，标记定位。碘伏常规消毒皮肤，铺巾，一般不用局麻药，若患者过分紧张或深部结节可适当予以局部麻醉后再行FNA，选择7号针头或22G～25GPTCD穿刺针，连接10mL注射器，右手持注射器经标记点皮肤刺入，平行法超声引导下进入肿块内，到达适当深度确定在肿块内后，回抽针栓，在维持负压的状态下，在肿块内多点、多方向，反复穿刺抽吸3~6次，观察针头内有少许淡褐色组织碎屑为佳。缓慢解除负压并退出针头。视标本量情况，每个结节最多重复穿刺3次，穿刺涂片2张，95%乙醇快速固定，常规巴氏染色封片，剩余组织反复洗脱于细胞固定液中，备细胞蜡块制备用，穿刺点局部有效按压至少30min，复查彩超无明显出血后患者方可离开。

细胞蜡块（cellblock）制备：固定在细胞固定液中的剩余细针穿刺组织，多次离心后弃去上清液，用琼脂沉淀包埋后，将凝固的细胞块切片，常规脱水、石蜡包埋、HE染色，镜检。并进行BRAFV600E突变免疫组化检测。

手术标本石蜡切片常规行BRAFV600E突变免疫组化检测。

1.3结果判断：免疫组化染色采用EnVision二步法，一抗BRAFV600E

（VE1）m中杉公司提供：二抗及DAB试剂盒均购自迈新公司。高倍视野（×400）下每张切片随机选择5个细胞巢，每个巢细胞数不少于10个，以<5%肿瘤细胞的细胞质染色为阴性，>5%肿瘤细胞的细胞质染色为阳性，根据染色的强度分为：淡褐色（1+）；淡棕色（2+）；深棕色（3+）。

1.4统计学方法：用SPSS19.0统计软件，计数资料以率表示，分类对比采用Crosstabs统计分析。

2结果

FNAB中甲状腺乳头状癌细胞核极具特征性，包括毛玻璃状（透明）细胞核、核内假包涵体、核沟、核仁、核的微丝等。53例PTC患者BRAFV600E突变蛋白表达阳性为43例，阳性率81.13%（43/53）。

术前UG-FNAB结合BRAFV600E突变检测阳性为38例，阳性率71.70%（38/53）。诊断符合率88.37%（38/43），特异性100.00%

（10/10），假阴性率11.63%（5/43）。与术后石蜡切片免疫组化检查相比2值1.31，P值0.25，提示差异无显著性，对照组10例良性结节中有0例BRAFV600E突变。

3讨论

BRAF基因全名为鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌基因同源体B1（v-rafmurinesarcomaviraloneogenehomologB1）是1988年由ShuntaRoikawa等在诱导禽原代细胞增殖和NIH3T3细胞的转化过程中发现并克隆确认的，属于RAF基因家族。BRAF是人类最重要的原癌基因之一，大约8%的人类肿瘤发生BRAF基因突变有关。BRAF基因V600E点突变具有很强的致癌作用，如促进恶变细胞包膜外浸润，淋巴结转移等，已经得到很多实验的证实。近年来，甲状腺乳头状癌的分子特征和通路研究日趋深入。BRAF突变是目前其最常见的突变形式，BRAF基因是下游MAPK信号通路最强的激活剂。近期一项Meta分析结果显示，BRAF突变与患者的复发、淋巴结转移、甲状腺外侵犯及AJCC分期（Ⅲ/IV期）有关。

甲状腺细针穿刺细胞学（fineneedleaspiration）作为甲状腺肿块常规标准诊断方法，具有创伤小，痛苦小，易为患者接受等优点，而且术中冰冻切片由于冰晶效应，常常造成细胞核空壳，呈假性“核内包涵体”，导致甲状腺乳头状癌的假阳性诊断，所以目前美国许多医院将术前FNA作为甲状腺术中冰冻的必要补充。

细胞蜡块切片中，瘤细胞相对集中，呈巢状分布，细胞核形态大小不一，细胞呈单层排列，没有细胞重叠拥挤现象，免疫组化效果好。同术后石蜡切片的免疫组化相比一致性较高，可作为术前FNA结合BRAFV600E突变检测简单、经济、可靠的检查方法。但如果穿刺标本量太少，影响CB的制作，容易造成假阴性诊断。

目前高频超声检查对于甲状腺结节的诊断敏感性为100%，但特异性仅为40.6%，FNA作为甲状腺结节良、恶性鉴别的可靠方法，其敏感度为83%（65%~98%），特异度为92%（72%~100%），由于不同治疗单位诊疗技术水平差异，即使FNA仍有较高误差。约有10%~40%的甲状腺结节通过穿刺活检不能确定性质。本组实验中采用FNA细胞蜡块结合BRAFV600E突变检测与术后病理相比，诊断符合率88.37%（38/43），特异性100.00%（10/10），对照组良性结节中BRAFV600E突变没有发现阳性，提示BRAFV600E突变没有假阳性，因此术前UG-FNAB结合BRAFV600E突变检测可提高恶性甲状腺结节的诊断率，由于BRAFV600E突变与甲状腺癌淋巴结转移密切相关，因此对甲状腺癌分层治疗及预后评估亦有指导意义。

参考文献

[1]詹维伟，徐上妍.甲状腺结节超声检查新进展[J].中华医学超声杂志（电子版），2013，10（2）：88-93.

[2]杜馥曼，杨玉芝，冯琨，等.Galectin-3和CD44v6在甲状腺癌中的表达及临床价值[J].放射免疫学杂志，2010，17