阻断HH信号通路对脑胶质瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用的实验研究

阻断HH信号通路对脑胶质瘤细胞增殖抑制与诱导凋亡作用的实验研究

范菁马力刘伟国

（浙江大学医学院附属第二医院）

【摘要】目的：研究Gli-1转录的特异性阻断剂GANT-61对胶质瘤细胞作用效果。方法：用GANT-61处理血清培养分化状态的BGSCs，用DMSO做对照组。观察对裸鼠致瘤能力是否改变。结果：GANT-61阻断后能明显抑制Gli-1的转录活性，细胞活性受抑制，丧失致瘤能力。对照组则无明显变化，组间差异有显著性。结论：GANT-61能通过抑制Gli-1的转录活性而阻断HH信号通路，丧失致瘤能力。

【关键词】胶质瘤干细胞；HH信号通路；Gli-1；GANT-61

【中图分类号】R2【文献标号】A【文章编号】9128-6509（2015）12-0071-01

脑胶质瘤是神经系统最常见的原发恶性肿瘤，占颅内肿瘤的33.3%-58.9%。近年来已有研究者先后从脑胶质瘤组织和细胞株中成功分离出脑胶质瘤干细胞（braingliomastencells,BGSCs），并认为它们在胶质瘤的发生、发展和复发中起决定性作用[3]。这为针对性的制定基因靶向治疗措施提供了理论依据和实用价值。在脑肿瘤中的研究发现：一些胶质瘤和髓母细胞瘤以及相应的模型系统的维持和存活需要HH信号；HH信号通路可能参与了胶质瘤的启动[9]；本实验以人胶质瘤细胞系U87-MG为对象，应用Gli-1转录抑制剂GANT-61在分化状态的BGSCs中阻断HH信号通路，以DMSO为对照组，观察对裸鼠致瘤能力的变化，探讨阻断HH信号通路对抑制肿瘤增长、诱导细胞凋亡的可能机制。

1材料和方法

对人脑胶质瘤细胞系U87-MG进行免疫磁珠分选，将收集的CD133+细胞接种到含有培养基中，5%CO2、37°C恒温培养。（1）RT-PCR提取RNA，检测BGSCs增殖、分化状态和正常脑组织中Gli-1的表达丰度，另取癫痫切除灶一例作为正常脑组织对照。引物按Genebank所提供的基因序列设计，由上海英俊生物技术公司合成。

Gli-1:5’-GCAGGGGGAGGACAGAACTTT-3’5’-GACAGGGGTTGGGGCCATAC-3’GAPDH:5’-AACGACCCCTTCATTGACCT-3’5’-GTCATCCCAGAGCTGAACGG-3’

图像分析：用凝胶成像仪分析DNA片段的灰度值。目的条带与该样本内参的灰度值之比越大WesternBlot提取蛋白，检测BGSCs增殖、分化状态和正常脑组织中Gli-1的表达丰度，另取癫痫切除灶一例作为正常脑组织对照。测定A570nm,读取吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。

MTT法细胞检测GANT-61对分化状态BGSCs细胞增殖抑制率，计算抑制率：细胞抑制率%=（OD对照组-OD实验组）/OD对照组。用药物浓度对抑制率绘制剂量-反应曲线，并求出相应的IC50值。

2致瘤能力的改变

收集药物处理组和对照组细胞共4组，以105个细胞/200ul分别接种于裸鼠背部皮下。8周后处死，观察有无肿瘤形成，如有则切取肿瘤组织，多聚甲醛固定后经脱水、石蜡包埋制成切片，免疫组化检测。

3结果

3.1胶质瘤干细胞的分选及鉴定

3.1.1免疫磁珠分选得到CD133+细胞

通过流式抗体标记并检测后我们发现磁珠分选前人胶母细胞瘤细胞系U87中含有3%左右（3.1%±0.6%）的CD133+细胞。而经免疫磁珠分选后的人胶质瘤CD133+细胞组经流式分选验证结果表明其阳性率超过50％（63.1%±8.4%）。同时形态学的观察发现在无血清培养基的培养条件下CD133+细胞大部分呈悬浮生长，并在7-14天后出现悬浮克隆球。而阴性组细胞则一开始呈不完全贴壁生长状态，基本停止分裂并大部分逐渐消亡；而在含血清培养基中，分选后的CD133+细胞可以继续贴壁分化生长，类似于分选前的细胞。

3.2Gli-1在BGSCs增殖、分化过程和正常脑组织中的表达胶质瘤干细胞增殖过程中保持悬浮克隆球的生长状态，分化过程中呈贴壁生长，形态同普通胶质瘤细胞基本相同，另取癫痫切除灶一例作为正常脑组织对照。RT-PCR检测HH通路下游基因Gli-1的表达。结果表明BGSCs增殖过程中Gli-1mRNA呈强表达，较分化状态下高16倍，分化状态下Gli-1mRNA表达较弱，但对比正常脑组织仍有明显增高，组间差异有显著性。WesternBlot的结果与RT-PCR结果一致，提示HH通路活性在BGSCs增殖和分化过程中均有异常激活，增殖过程中更为明显。

3.3.5GANT-61对致瘤能力的影响

我们将血清培养的分化状态的BGSCs与5uMGANT-61共培养7天后制备成105个细胞/200ul浓度的细胞悬液，分别将其接种到4只裸鼠的背部皮下，接种后2周所有裸鼠接种部位均未见明显种植瘤生长，连续观察3个月，仍无肿瘤形成，致瘤率0且接种后本组裸鼠生长、进食等行为活动均无明显异常。而对照组中4只裸鼠2周内均可在接种部位触及皮下瘤结节，致瘤率100%。

4讨论

胶质瘤治疗的最大困难在于复发，这与肿瘤细胞中存在一小部分具有自我更新、无限增殖、多向分化能力的肿瘤干细胞有关[19,20]，已有多位国内外学者从脑胶质瘤组织和细胞株中成功分离出了脑胶质瘤干细胞[21-25]，它们在胶质瘤的发生、发展和复发中起了决定性的作用。CD133是迄今为止最为公认的胶质瘤干细胞分子标记[26-28]，我们的实验通过免疫磁珠分选技术(MACS)从人胶质瘤细胞系U87-MG中成功分离出一小部分CD133+细胞。采用二次过柱的方法有效的保证了阳性率，并且通过流式细胞仪检测验证发现分选得到的这部分细胞中CD133阳性率在60%左右，较U87细胞在基础状态下CD133阳性率（3%左右）提高了近20倍，基本达到了分选的纯度要求。

HH信号通路是近年来研究的热点，它在人体胚胎发育过程对各器官的细胞分化和增殖起重要作用。在神经系统的发育中，HH信号通路参与多种功能的调控，包括：HH信号可能调控SVZ区、海马和嗅球等部位祖细胞的自我更新以及小脑中颗粒状细胞前体细胞的增殖；在前期实验中我们发现GANT-61不能明显促进无血清培养的BGSCs增殖状态下的凋亡，提示BGSCs的增殖和凋亡可能由多条信号通路共同调控，其机制较为复杂，有待进一步深入研究。

经GANT-61处理后的胶质瘤细胞移植裸鼠皮下后未见肿瘤生长，而对照组则有明显的肿瘤形成，提示GANT-61对胶质瘤细胞有增殖抑制作用，可能是抑制了BGSCs的增殖或分化，还有待进一步的研究证实。